宋 英，寿丽蒙，陈曼婷

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)



依达拉奉减轻毒死蜱诱导的PC12细胞损伤

宋 英，寿丽蒙，陈曼婷

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

验证毒死蜱对神经细胞的损伤作用，并探究依达拉奉对毒死蜱诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制.MTT法摸索毒死蜱最佳损伤浓度以及依达拉奉最佳保护浓度，设立正常空白对照组、毒死蜱损伤模型组和依达拉奉保护毒死蜱损伤组，倒置显微镜下观察PC12细胞形态，Hocehst33342染色，荧光显微镜下观察各组细胞凋亡情况，western-blot检测各组全细胞Nrf-2蛋白表达变化情况.结果表明：MTT法确定最佳毒死蜱损伤浓度为200 μmol/L，依达拉奉最佳保护浓度为25 μmol/L；光学显微镜下观察细胞形态，依达拉奉可减轻毒死蜱诱导的PC12细胞损伤；Hocehst33342染色显示毒死蜱可诱导PC12凋亡，依达拉奉减轻了毒死蜱对PC12的损伤；western-blot结果显示依达拉奉组全细胞Nrf-2蛋白表达明增加，多于正常组和毒死蜱损伤组，正常组和毒死蜱组表达量相近.毒死蜱对PC12细胞具有损伤作用，可诱导细胞凋亡；依达拉奉具有减轻毒死蜱对PC12细胞损伤作用的功能，其保护机制可能是通过Nrf-2作用的.

依达拉奉；毒死蜱；大鼠嗜铬细胞瘤细胞株；Nrf-2

有机磷农药(Organophosphates，OPs)在我国是使用范围最广、使用量最大的一种杀虫剂，早期主要包括敌敌畏、甲拌磷、对硫磷和甲胺磷等，多为高毒品种，对人、畜毒性很强，环境污染严重.2008年1月底，我国彻底停止了甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷胺等5种高毒有机磷农药的生产、流通和使用.毒死蜱(Chlorpyrifos，CPF)作为一种替代高毒农药的高效、中毒杀虫剂，已成为有机磷类杀虫剂的主流产品，被广泛应用.随着应用范围的扩大及使用量的增加，人们逐渐意识到毒死蜱的潜在危险性，其对生态环境的污染以及对人类健康的危害日益引起国内外学者的重视.Jeong Eun Lee等率先用人体神经祖细胞(Human neural precursor cells，hNPCs)模型证明毒死蜱可降低细胞活力，增加乳酸脱氢酶的释放，诱导活性氧ROS的产生，具有细胞毒性，数据显示毒死蜱很可能具有影响神经发育的作用[1].流行病学研究也发现有机磷农药暴露与帕金森病(Parkinson’s diesase，PD)的发生有一定关联.Slotkin等用分化的PC12细胞比较了毒死蜱、二嗪农(diazinon)、狄氏剂(dieldrin)和二价镍(Ni2+)对帕金森病相关基因转录的影响，发现有机磷类农药毒死蜱和二嗪农，虽然作用方式不同，但是都明显地改变了帕金森病相关基因的表达，表明有机磷农药的暴露是帕金森发病的潜在危险因素[2].

大量研究结果显示活性氧或自由基在神经变性疾病的发生发展中发挥着重要作用.相对其他组织，大脑耗氧量高，抗氧化剂水平较低，且膜结构中含有更多可氧化的不饱和脂肪酸，更容易受到氧化损伤.在发育阶段的大脑为了满足生长需求，代谢加剧，但抗氧化剂储备量却仍处于发育阶段的较低水平，氧化应激对其带来的损伤作用远远高于成熟大脑[3].依达拉奉(Edaravone)作为一种强力自由基清除剂，可抑制氧化应激，延缓神经变性疾病的发生发展，具有脑保护作用，可作为潜在的神经变性疾病治疗药物.Xiong N等在鱼藤酮诱导帕金森病大鼠模型中发现，依达拉奉可以抑制活性氧的产生、抑制促凋亡蛋白Bax的表达和上调囊泡单胺转运体的表达等作用，减轻鱼藤酮导致的全身僵硬，抑制中脑线粒体损伤和多巴胺神经元的退化，提示依达拉奉可能是帕金森病的潜在治疗药物[4].然而依达拉奉应用于临床的可行性和确切作用机制还需要进一步的理论依据.环境中残留的不至于引起急性中毒症状的有机磷，不易被人体察觉，常常被忽视，因此长期暴露于低水平有机磷环境的危害必须得到证实并加以控制.基于这一研究目的，用PC12细胞建立有机磷农药毒死蜱损伤模型，研究依达拉奉对毒死蜱损伤的保护作用及其潜在机制，对长期暴露于低水平有机磷环境的危险性加以证明，并为依达拉奉的临床广泛应用提供理论参考.

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 试剂

依达拉奉(先声药业，南京)；毒死蜱(CPF，浙江新农化工股份有限公司)；二甲基亚砜DMSO(Sigma-aldrich，美国)；二苯基四氮唑溴盐MTT(上海生物技术有限公司)；Hoechst33342(南京凯基生物科技发展有限公司)；DMEM高糖培养基(吉诺生物医药科技有限公司，杭州)；胎牛血清(四季青，杭州)；胰酶溶液-EDTA含酚红(南京凯基生物科技发展有限公司)；PC 12 细胞(上海中科院细胞所).

2.1.2 仪器耗材

细胞培养瓶、96 孔板、离心管和培养皿(Nest，中国)；生物安全柜(ESCO，新加坡)；二氧化碳细胞培养箱(Thermo，美国)；电子天平(METTLER TOLEDO，美国)；倒置荧光显微镜(Nikon，日本)；酶标仪(BioTek，美国)；台式高速离心机(Thermo，德国)；台式高速冷冻离心机(HERMLE，Z36HK，德国)；电泳仪(Bio-red，美国)；化学发光成像系统(Bio-red，美国)；4 ℃冰箱(西门子，中国)；-20 ℃冰箱(中科美菱，中国)；-80 ℃冰箱(Thermo，美国).

2.2 毒死蜱对PC12细胞最佳损伤浓度摸索

将细胞以1×104的密度接种于96 孔板，每孔100 μL；6 h后加药，弃去原培养液，毒死蜱溶解于DMSO，用培养液稀释毒死蜱溶液，设立毒死蜱浓度梯度为50，100，150，200，250 μmol/L，DMSO终含量都为1%；作用24 h候之后，弃去含药培养液，PBS清洗一遍，加入培养液100 μL，再加入MTT溶液10 μL(MTT质量浓度为5 mg/mL)，细胞培养箱放置3 h；3 h后吸去每孔中溶液，加入DMSO各150 μL，充分溶解结晶后使用酶标仪在490 nm波长下检测吸光度，记录OD值用于确定最佳损伤浓度.

2.3 依达拉奉对毒死蜱诱导PC12细胞损伤的最佳保护浓度摸索

以1×104的密度将细胞接种于96 孔板中，每孔100 μL.6 h候后加药，用2.2节中确定的毒死蜱最佳损伤浓度建立损伤模型，设立空白组、毒死蜱损伤组和依达拉奉保护毒死蜱损伤组，其中依达拉奉保护损伤组设立依达拉奉浓度梯度为5，25，50，100，200 μmol/L，作用24 h候之后，弃去含药培养液，PBS清洗一遍，加入培养液100 μL，再加入MTT溶液10 μL(MTT质量浓度为5 mg/mL)，细胞培养箱放置3 h；3 h后弃去每孔中溶液，加入DMSO各150 μL，充分溶解结晶后使用酶标仪在490 nm波长下检测吸光度，记录OD值用于确定依达拉奉最佳保护浓度.

2.4 倒置显微镜PC12细胞形态学观察

将PC12细胞接种与6 孔板中，设立正常组、毒死蜱损伤组和依达拉奉保护毒死蜱损伤组，6 h后按照2.2节和2.3节中的最佳损伤浓度和最佳保护浓度给药，给药方式及操作步骤同2.3，作用24 h后，倒置显微镜下观察各组PC12细胞形态.

2.5 Hoechst33342细胞核染色

以1×104的密度将细胞接种于96 孔板中，每孔100 μL，设立正常组、毒死蜱损伤组和依达拉奉保护毒死蜱损伤组，加药作用24 h后加入终质量浓度为5 μg/mL的Hoechst33342进行染色，每孔30 μL，避光静置15 min后，吸去Hoechst33342液体，加入PBS清洗一遍后每孔加入不含酚红的DMEM培养基100 μL，在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况.

2.6 Western blot检测Nrf-2蛋白表达情况

2.6.1 细胞培养

将PC12细胞培养与培养皿中，设立正常组、损伤组和保护组，正常组为空白细胞组，损伤组给予毒死蜱最佳损伤浓度处理24 h，保护组给予相同毒死蜱浓度以及依达拉奉最佳保护浓度处理24 h.

2.6.2 全细胞蛋白提取

药物处理24 h后，弃去原培养液，各组加入适量PBS清洗2 次，洗去剩余培养液，用细胞刮刀收集细胞，每个皿加入200 μL细胞裂解液(含PMSF，终浓度为1 mmol/L)，用枪吹打数次，使所有细胞充分接触裂解液(以上都在冰上操作)，充分裂解后，4 ℃，12 000 g离心4 min，取上清，-80 ℃保存用于后续实验.

2.6.3 蛋白质量浓度测定

一管蛋白标准品(20 mg BSA)中加入0.8 mL蛋白标准配制液，充分溶解后即为25 mg/mL的蛋白标准溶液；取适量上述25 mg/mL的蛋白标准溶液，使用PBS稀释至0.5 mg/mL，即为最终标准品终质量浓度；V(BCA试剂A)∶V(BCA试剂B)=50∶1，按此比列充分混匀，备用；96 孔板中，将标准品0，1，2，4，8，12，16，20 μL分别加入96 孔板中；取适量体积的样品加入96 孔板中，加入PBS使上述每个标准品孔和样品孔最终体积都为20 μL；各孔加入BCA工作液200 μL后，放96 孔板于37 ℃，20～30 min；使用酶标仪在562 nm波长下测定吸光度，根据标准品曲线计算出样品的蛋白质量浓度.

2.6.4 蛋白变性

由2.6.3节中检测的各组蛋白质量浓度，使用双蒸水将各组蛋白定量成同一质量浓度，取适量，分别加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)，体积比为V(蛋白样品)∶V(上样缓冲液)=4∶1，混匀后沸水中加热3～5 min，充分变性蛋白，冷却到室温后，-80 ℃封口保存，用于后续实验.

2.6.5 凝胶电泳

根据蛋白分子量配制10%分离胶和5%浓缩胶，制胶成功后，在加样孔中上样，同时加一组彩色预染蛋白作为之后蛋白分子量判断条带；100 V恒压电泳，30 min后，调节电压至150 V，直至溴酚兰到达分离胶底部，停止电泳，取出整片胶，根据彩色预染蛋白条带及Nrf-2蛋白分子量切胶.

2.6.6 转膜

裁剪一张与凝胶大小形状相符的硝酸纤维素膜，浸泡于转移液中，转移装置中依次为正极板、海绵、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸、海绵和负极板，铺好之后使用玻璃棒滚压，赶尽凝胶与硝酸纤维素膜之间的气泡，放入转膜仪器中，300 mA电流，持续冰浴，90 min左右.

2.6.7 抗体孵育

取出硝酸纤维素膜，放入封闭液中；摇床上封闭2 h后，取出硝酸纤维素膜放入一抗中，摇床上室温孵育0.5 h后置于4 ℃冰箱孵育过夜；一抗孵育结束后，取出，使用TBST清洗3次，摇床，每次10 min；清洗结束后把膜浸没于二抗中，室温摇床孵育2 h；二抗孵育结束后，使用TBST清洗3 次，摇床，每次10 min.

2.6.8 显影

按V(A液)∶V(B液)=1∶1的比例配制ECL显影液(使用前配制，尽量避光)，在化学发光成像仪样品板上，事先铺上一层保鲜膜，将2.6.7节中清洗结束的硝酸纤维素膜置于保鲜膜上，尽量确保膜在成像板正中间，在膜上以及膜的四周滴上适量刚配制的ECL显影液，运行仪器，显影.

2.7 统计方法

数据通过 GraphPad Prism 软件(One-way ANOVA)分析，用mean±SD表示，设置在p<0.05水平时有统计学意义.

3 实验结果

3.1 毒死蜱对PC12细胞损伤作用

按照2.2节的实验步骤，设立毒死蜱浓度梯度50，100，150，200，250 μmol/L，作用于PC12细胞24 h之后，酶标仪490nm波长检测吸光度记录各组OD值.处理数据见图1，图1中，以空白对照组的MTT吸光度值为100%，用其余各组吸光度值与空白对照组的比例表示为细胞存活率，结果如图1所示，随着毒死蜱浓度的增加，细胞存活率下降，呈一定的负相关(R2=0.928 8)，表明毒死蜱对PC12细胞的损伤随着浓度的增加损伤程度不断增大.当毒死蜱浓度为200 μmol/L时，细胞存活率为63%，据此选择毒死蜱浓度200 μmol/L作为最佳损伤浓度，用于建立后续损伤实验模型.

图1 不同浓度毒死蜱对PC12细胞的作用Fig.1 The effects of CPF on PC12 cells

3.2 依达拉奉对毒死蜱诱导PC12细胞损伤的保护作用

选取3.1节中毒死蜱最佳损伤浓度200 μmol/L，作为之后实验中依达拉奉保护的损伤模型浓度，建立空白对照组、毒死蜱损伤模型组和依达拉奉保护毒死蜱损伤组，设立依达拉奉浓度梯度5，25，50，100，150 μmol/L，作用24 h后同样使用酶标仪在490 nm波长下检测吸光度值并记录，处理数据得结果如图2所示，以空白对照组的MTT吸光度值为100%，用其余各组吸光度值与空白对照组的比例表示为细胞存活率.依达拉奉对毒死蜱的损伤具有保护作用，图2中所示当依达拉奉浓度为25 μmol/L时，细胞存活率最高，最接近空白对照组，选择此浓度作为依达拉奉最佳保护浓度.

图2 不同浓度依达拉奉对毒死蜱损伤PC12细胞的作用Fig.2 The effects of Edaravone on PC12 cells injured by CPF

3.3 PC12细胞形态学观察

6 孔板中，设立正常组、毒死蜱损伤组和依达拉奉保护毒死蜱损伤组，加药作用24 h候，在倒置显微镜下观察PC12细胞形态.得各组细胞形态如图3所示，图3(a)为正常对照组细胞，细胞形态完整，突起生长正常；图3(b)为毒死蜱损伤组，相较于正常组，细胞密度稀疏，细胞形态不完整，尤其是突起的生长，长度不及正常组，甚至消失；图3(c)为依达拉奉保护毒死蜱损伤组，细胞形态接近正常组，突起生长状况良好，较少见突起完全消失的细胞，细胞密度相比于损伤组有增加.可见，依达拉奉对毒死蜱诱导的PC12细胞损伤具有一定的保护作用，可减轻PC12的损伤.

图3 依达拉奉对CPF诱导PC12损伤细胞形态变化的影响Fig.3 Effect of Edaravone on PC12 cells morphological changes induced by CPF

3.4 Hoechst33342染色观察细胞凋亡

Hocehst33342染料可进入细胞膜，对细胞核进行染色，根据细胞膜的通透性进入多少最终显示为细胞核染色荧光强弱不同，凋亡细胞细胞膜通透性强于正常细胞，所以进入细胞内的Hoechst33342染料多于正常组，细胞核染色呈亮蓝色，蓝色荧光强度强于正常组，根据荧光强度区别凋亡细胞和正常细胞.将细胞接种于96 孔板中，设立正常组，毒死蜱损伤组，依达拉奉保护毒死蜱损伤组，加药作用24 h进行Hocehst33342染色，在荧光显微镜下观察细胞染色情况如图4所示，图4(a)为正常组，图4(b)为毒死蜱损伤组，图4(c)为依达拉奉保护组，比较之下，毒死蜱损伤组细胞核染色明显呈亮蓝色，细胞密度也与光学显微镜下观察相符，较为稀疏，说明毒死蜱可损伤PC12细胞，诱导其凋亡；依达拉奉保护组染色与正常组相近，显示依达拉奉在一定程度上减轻了毒死蜱对PC12的损伤作用.

图4 Hocehst33342染色观察各组细胞凋亡情况Fig.4 Cell apoptosis in different groups stained by Hocehst33342

3.5 Western blot检测Nrf-2全细胞表达变化

设立正常组、毒死蜱损伤组和依达拉奉保护毒死蜱损伤组，提取蛋白后western-blot检测蛋白表达情况.结果如图5所示，依达拉奉组全细胞Nrf-2蛋白表达明显多于正常组和毒死蜱组，而毒死蜱组该蛋白表达接近与正常组，结合与损伤组Nrf-2表达量的比较，推测依达拉奉减轻毒死蜱诱导的PC12细胞损伤作用机制可能是通过Nrf-2实现的.

图5 Western blot检测全细胞Nrf-2表达情况Fig.5 Western blot analysis Nrf-2 expression in whole cell level

4 讨 论

Slotkin等首先用SD大鼠乳鼠比较了毒死蜱和二嗪农的神经发育毒性作用，虽然二者作用不完全相同，但是数据证实两者都具有神经发育毒性，而两者作用方式的不同也提示需要进一步的实验研究来揭示有机磷农药的作用机制[5-6].Roegge等研究发现新生鼠暴露于低浓度的毒死蜱和二嗪农，都可导致行为学的变化[7].Timofeeva等证实低浓度对硫磷可导致持续的行为变化[8-9]，再一次为长期低浓度暴露有机磷的危险性加以证明，有机磷类农药作用机制急需明确.Slotkin等采用PC12细胞为体外模型，通过比较不同神经发育毒性剂毒死蜱、二嗪农和狄氏剂和二价镍，试揭示这类胆碱酯酶依赖的神经发育毒性剂的作用机制[10]，Slotkin的研究也发现有机磷农药毒死蜱可引起氧化应激，细胞丢失，并可改变神经分化[11-15].顾娟等通过小鼠及体外培养小鼠胚胎端脑细胞实验发现低浓度毒死蜱可显著引起端脑神经细胞凋亡，并对小鼠的空间记忆能力具有一定影响[16].

相关文献报道，毒死蜱可引起神经细胞氧化应激，进而诱导细胞凋亡，而Nrf2(NF-E2-related factor 2)是细胞氧化应激反应中的关键因子，正常条件下，Nrf-2以未活化状态存在与细胞浆中，当细胞发生氧化应激时，Nrf-2活化进入细胞核，与相关的抗氧化反应元件ARE(Antioxidant response element)结合，启动一系列抗氧化蛋白的转录表达.本文实验结果表明：毒死蜱对PC12细胞有损伤作用，显微镜下显示毒死蜱损伤组的细胞，细胞扁平，整体形态不完整，尤其表现在对突起的影响，毒死蜱损伤后多数PC12的突起生长不完整，长度明显比正常组细胞细短，甚至出现不少细胞突起消失；Hocehst33342染色也显示毒死蜱损伤组细胞多数凋亡，结合western blot检测Nrf-2蛋白表达结果，毒死蜱可损伤PC12细胞，诱导细胞凋亡；给予依达拉奉处理后，光镜下细胞形态学的观察、Hocehst33342染色凋亡情况及western-blot蛋白表达结果一致显示，依达拉奉可减轻毒死蜱对PC12细胞的损伤作用，Nrf-2蛋白含量较损伤组明显增多，一定程度上加速了抗氧化进程，缓解了细胞氧化应激，减少了毒死蜱引起的PC12细胞凋亡，其保护作用据实验结果推测由上调Nrf-2蛋白表达量实现，而具体的机制，仍需进一步实验证明.

5 结 论

毒死蜱对PC12细胞具有损伤作用，可导致PC12细胞氧化应激，诱导细胞凋亡；依达拉奉具有减轻毒死蜱诱导的PC12细胞损伤作用，其保护机制与上调Nrf-2蛋白表达量有关.

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[16] 顾娟.低浓度毒死蜱对小鼠胚胎端脑细胞体外培养及远期空间记忆的影响[D].杭州:浙江工业大学,2012.

(责任编辑：陈石平)

Edaravone protects PC12 cells from CPF-induced damage

SONG Ying, SHOU Limeng, CHEN Manting

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 31014, China)

To evaluate both the damage of chlorpyrifos to PC12 cells and the effect of edaravone on protecting PC12 cells from chlorpyrifos-induced damage, as well as to uncover its possible protective mechanism, MTT method was used to determine the most appropriate concentration of CPF and to evaluate effects of different concentrations of protecting group, we perform a trial pilot study for the control group, the model group injured by CPF and the protecting group treated with CPF and edaravone, using a fluorescent inverted microscope to observe the cell mophology of all groups. Cell apoptosis in different groups were observed by Hocehst33342 stain and the western blot was used to detect the expressions of Nrf-2 in different groups. MTT find out that the most appropriate concentration of CPF is 200 μmol/L, and the most appropriate concentration of edaravone is 25 μmol/L. The cell mophology observation and the Hocehst33342 stain show that CPF can injury PC12 cells and lead to cell apoptosis, the administration of edaravone has a protective effect on the PC12 damage induced by CPF. The increasing expression of Nrf-2 in protecting group is more obviously than both control group and model group shown by western blot, while that of Nrf-2 in model group is similar to that in control group. CPF can cause PC12 injury and lead to cell apoptosis, edaravone can protect PC12 cells from damage induced by CPF, its proper mechanism maybe related to the expression of Nrf-2.

edaravone; chlorpyrifos; PC12; Nrf-2

2016-03-13

浙江省自然科学基金资助项目(LY17H090018)；全国临床药学研究基金资助项目(L2011079)

宋 英(1968—)，女，浙江绍兴人，副教授，研究方向为神经药理学，E-mail： songying@zjut.edu.cn.

R965

A

1006-4303(2016)06-0654-06