徐少华

（深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东深圳 518005）

高效液相色谱法测定鸡肉中六种四环素的方法研究

徐少华

（深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东深圳 518005）

建立高效液相色谱法测定鸡肉中6种四环素的方法。优化色谱条件，色谱柱为Agilent SB C18，150* 4.6 mm，配紫外荧光检测器350 nm，柱温25℃，进样体积50 μL，流动相0.01 mol·L-1草酸+乙腈，0到15 min的乙腈比例从5%～40%。通过研究对比试验，发现利用HLB和羧酸根阳离子交换柱两种固相萃取小柱可以充分去除杂质干扰，分别选择乙酸乙酯洗脱HLB柱，含15%乙腈的0.01 mol·L-1草酸溶液作为阳离子交换柱的洗脱液。通过以上试验方法，可以同时测定鸡肉中6种四环素的含量，并且结果具有良好的精密度和准确度，该方法可用于鸡肉中四环素残留的检测。

高效液相色谱法；四环素；色谱条件；净化

四环素类抗生素（TCs）是人类和动物临床上广泛使用的广谱抗生素。TCs作为广谱抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及立克次氏体等均有较好的抑制作用[1-4]。TCs在动物肌肉、内脏等组织中残留[5-8]，能对食用人群的健康产生不良的影响甚至可以致病。因此，许多国家对TCs残留进行监控。我国和欧盟对TCs的最高残留限量规定，食用性动物肌肉组织中TCs含量≤100 μg·kg-1。

目前，动物源性食品中TCs等药物残留的检测方法主要有微生物法、免疫分析法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等，其中高效液相色谱法具有高效、快捷、灵敏度和检出率高的优点，且易推广，是目前使用最广泛的方法，但高效液相色谱法对样品前处理要求较高，若样品前处理不好，易出现杂峰，从而影响目标物质的测定[9-13]。液相色谱条件也同样对多种目标物质峰的分离有极大影响。本文通过优化前处理以及色谱条件，为同时测定6种四环素提供方法依据。

1 试验设备与材料

1.1 试验设备

高效液相色谱仪，配紫外检测器（Agilent 1260），分析天平，固相萃取真空装置，pH计，超声提取仪，sigma高速冷冻离型机，超纯水器，水浴氮气吹干仪，旋转式振荡器。

1.2 材料与试剂

市售鸡肉，双圈定量滤纸，滤膜（0.22 μm，水相）Oasis HLB固相萃取小柱（500 mg，6 mL），使用前用甲醇10 mL和水10 mL活化；羧酸根阳离子交换柱5 mg，3 mL，使用前用乙酸乙酯活化。甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色谱纯）、草酸（分析纯）、乙二胺四乙酸二钠。

TCs标准品：二甲胺四环素（MNC），土霉素（OTC），四环素（TC），去甲基金霉素（DMCT），金霉素（CTC），强力霉素（DC），纯度均≥96%。

2 试验方法

2.1 色谱条件

流动相梯度条件见表1。

表1 流动相梯度条件

本试验研究了流动相梯度条件，结果由表1可知，色谱柱为Agilent SB C18，150*4.6 mm；流速为1.0 mL·min-1；进样量为50 uL；流动相为15%乙腈的0.01 mol·L-1草酸溶液。

2.2 标准溶液配置

准确称取按其纯度折算为100%质量的MNC、OTC、TC、DMCT、CTC、DC各10.0 mg，分别用甲醇溶解并定容至100 mL，浓度相当于100 μg·mL-1，储备液在＜-18℃贮存于棕色瓶中，备用。

2.3 工作曲线的配置

准确量取MNC、OTC、TC、DMCT、CTC、DC储备液，用流动相定容至10 mL棕色容量瓶中配置成混标，并逐级对混标稀释成10、20、50、100、200、400 ng·mL-1不同浓度混合标准工作液。

2.4 测定步骤

2.4.1 提取

称取均质试样4 g（精确到0.01），置于50 mL聚丙烯离心管中，分别用约0.1 mol·L-1EDTA-Mcllvainc缓冲溶液20 mL、10 mL冰水浴超声提取两次，每次涡旋混合1 min，超声提取10 min，冷冻使提取液低于4℃，8 000 r·min-1冷冻离心5 min，合并上清液，混匀，8 000 r·min-1离心20 min（温度＜4℃），用快速定量滤纸过滤，待净化。

2.4.2 净化

将上清液倒入Oasis HLB固相萃取柱，上清液以≤3 mL·min-1的流速通过固相萃取柱，待上清液完全流出后，用5 mL去离子水和5 mL（甲醇1+水19）洗柱，弃去全部流出液。在65 kPa的负压下，减压抽干20 min，最后用10 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于15 mL离心管中。将上述洗脱液在减压情况下以≤3 mL·min-1的流速通过羧酸型阳离子交换柱，待洗脱液全部流出后，用5 mL甲醇洗柱，弃去全部流出液。在65 kPa负压下，减压抽干5 min，再用4 mL流动相洗脱，收集洗脱液于5 mL样品管中，定容至4 mL，供液相色谱-紫外检测器测定。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

3.1.1 流动相改性剂的选择

本试验分别以0.01 mol·L-1草酸、0.01 mol·L-1柠檬酸、和0.01 mol·L-1三氟乙酸为改性剂，分析了不同改性剂对四环素类药物分离度和峰形的影响。结果表明，3种改性剂均能使6种四环素类药物有效分离，以三氟乙酸为流动相改性剂色谱峰保留时间较长，峰型有些拖尾，柠檬酸比草酸的灵敏度要低一些，草酸为挥发性酸，从对色谱峰灵敏度和保留时间角度考虑，选择草酸作为本试验流动相改性剂。

3.1.2 流动相梯度选择

本试验中研究了有机相与水相的比例对6种TCs药物分离效果的影响。结果表明，在一定范围内，有机相的比例越高，分析速度越快，响应值越高，检测灵敏度就越高；当流动相中不含甲醇时，分析速度快，检测灵敏度高，分离度变差；当流动相中不含乙睛时，分析速度慢，检测灵敏度低。当用实际样品进行分析时，样品基质对被测物的干扰较大，按梯度洗脱时，干扰基本消除，分析时间缩短，灵敏度大大提高。

3.2 净化条件的选择

3.2.1 固相萃取小柱选择

100ng·mL-1混合标准品经过Oasis HLB固相萃取柱净化色谱图见图1。100 ng·mL-1混合标准品经过Oasis HLB和羧酸根阳离子交换柱净化色谱图见图2。

图1 100 ng·mL-1混合标准品经过Oasis HLB固相萃取柱净化色谱图

图2 100 ng·mL-1混合标准品经过Oasis HLB和羧酸根阳离子交换柱净化色谱图

对比了用OasisHLB单一固相萃取柱净化和Oasis HLB、羧酸根阳离子交换柱双柱净化效果。由图1、图2可知，通过实际样品加标对比试验发现，只用HLB柱的除杂效果差，杂质干扰峰较多，出现重叠峰；经过双柱净化，6种目标物质无干扰峰。故本试验选用双柱净化样品。

本试验净化过程中需要注意的是，洗脱Oasis HLB之前要尽量抽干，如果不能完全抽干，在乙酸乙酯洗脱过程中，HLB柱残留水相会一同流出，导致洗脱液有分层现象，则在过羧酸根阳离子交换柱时，只将上层的乙酸乙酯洗脱液层过柱。试验发现，如果将带有水相的洗脱液一起过羧酸根阳离子交换柱，则目标物质将跟随乙酸乙酯混合液一同流失，不被保留于固相萃取小柱上。

3.3 方法的线性与检出限

四环素类药物回归方程、相关系数和检出限见表2。

在上述色谱条件下，6种TCS相关系数r≥0.999，按3倍仪器信噪比计算检出限。

3.4 加标回收率和精密度试验

加标回收率及精密度见表3。取空白鸡肉样品18份，分3组进行50、100和200 μg·kg-1添加水平按上述实验方法进行回收率和精密度试验。由表3可知，本方法的3种浓度试验回收率为71.8%～ 103.9%，相对标准偏差为2.30%～7.81%，具有较好的精密度和准确度。

表2 四环素类药物回归方程、相关系数和检出限

表3 加标回收率及精密度

4 结论

试验建立了高效液相色法同时测定鸡肉组织中二甲胺四环素、土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉素和强力霉素6种四环素族抗生素残留量的方法。试验结果表明，以0.01 mol·L-1草酸与乙腈在15 min内梯度洗脱可使目标峰完全分离，峰形良好。通过对比前处理净化步骤，发现Oasis HLB和羧酸根阳离子交换柱可以使样品达到很好的除杂效果，避免杂质峰的影响。经过加标回收和精密度试验，发现该方法完全可以达到同时测定6种四环素的效果。

[1]闫小峰.超高效液相色谱法检测鸡蛋中5种四环素类药物残留方法研究[D].北京:中国农业科学院,2010.

[2]贺德春,许振成,吴根义,等.四环素类抗生素的环境行为研究进展[J].动物医学进展,2011,32（4）:98-102.

[3]陈育枝,张元元,袁希平,等.动物四环素类抗生素现状及前景[J].兽药与饲料添加剂,2006,11（3）:16-17.

[4]裴立忠,王勇平,张鹏,等.四环素类抗生素生产状况与市场发展前景[J].中国兽药杂志,2015,49（1）:64-68.

[5]张大文,王冬根,胡丽芳,等.猪肉产品中四环素类药物残留风险评估[J].农产品质量与安全,2014（6）:34-37.

[6]张美金,林峰,林海丹,等.饲料中四环素类药物含量的高效液相色谱测定[J].分析测试学报,2007,26（6）:918-920.

[7]刘妮,叶能胜,谷学新,等.动物源性食品中四环素类残留分析研究进展[J].分析科学学报,2009,25（3）:351-356.

[8]闫小峰.四环素类抗生素残留检测方法研究进展[J].中国兽药杂志,2010,44（5）:47-50.

[9]葛云芝,于小波,周光宏,等.高效液相色谱法同时测定鸡肉中3种四环素类抗生素残留[J].食品科学,2013,34（10）:180-183.

[10]夏天骄,夏训峰,徐东耀,等.基于固相萃取-高效液相色谱法的畜禽粪便中四环素类抗生素残留量检测[J].安全与环境学报,2013,13（2）:121-125.

[11]沈颖,魏源送,郭睿,等.超高效液相色谱串联质谱检测猪粪中残留的四环素类抗生素[J].环境化学,2000,28（5）:747-752.

[12]张银志,阮起郡,孙秀兰.高效液相色谱法检测鸡蛋中3种四环素类抗生素[J].安徽农业科学,2008,36（2）:404-405.

[13]张鑫,顾欣,严凤,等.高效液相色谱法检测畜禽肉中四环素类药物残留的条件优化[J].化学分析计量,2010,19（5）:55-58.

Research on Determination of Six Kinds of Tetracycline in Chicken by HPLC

XU Shaohua

（Shenzhen Agricultural Product Quality Safety Inspection Testing Center,Shenzhen 518005,Guangdong China）

To establish a HPLC method with the determination of six kinds of tetracycline in chicken,chromatographic column for Agilent SB C18 150*4.6 mm,ultraviolet fluorescence detector 350 nm,column temperature 25℃,sample size 50 μL and mobile phase was 0.01 mol·L-1oxalic acid+acetonitrile.Acetonitrile proportion increased from 5%to 40%in 15 minutes.Through the contrast experiment,found the use of HLB and carboxylic acid pillar of cation exchange,two kinds of solid phase extraction small column could fully remove impurity interference and chose ethyl acetate elution HLB respectively,15%acetonitrile 0.01 mol·L-1oxalic acid solution as the eluent cation exchange column.Through the above experiment method,could simultaneously determine the content of six kinds of tetracycline in chicken,and the results had good precision and accuracy.This method could be used for tetracycline residue inchicken.

HPLC;tetracycline;chromatographic conditions;purification

S831；S816.7

A

1001-0084（2016）11-0006-05

2016-08-18

徐少华（1991-），男，浙江衢州人，助理工程师，主要从事兽药残留检测工作。