潘孝成，赵瑞宏，沈学怀，张丹俊，胡晓苗，周学利，戴银，侯宏艳，钱坤

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥230031）

猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的制备与应用

潘孝成，赵瑞宏，沈学怀，张丹俊，胡晓苗，周学利，戴银，侯宏艳，钱坤

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽合肥230031）

用猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）SD株免疫产蛋鸡，收集卵黄制备出特异性PEDV抗体。人工感染后治疗结果显示，一次抗体治疗组可减少死亡率50.0个百分点，两次抗体治疗组可减少死亡率83.3个百分点；3家自然发病猪场的临床应用表明，相较于对照组，抗体治疗组可减少仔猪死亡率分别为67.7个百分点、57.0个百分点和77.5个百分点。

猪流行性腹泻病毒；卵黄抗体；制备；应用

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链有囊膜的RNA病毒，是一种可导致猪以水样腹泻、呕吐和脱水为特征的传染病原。1971年，猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）首次在英国发现[1]，我国内地自20世纪80年代初以来陆续有关于PEDV分离和鉴定的报道[2]。2010年以来，我国猪流行性腹泻的危害一直比较严重[3-5]。特异性的卵黄抗体是一种易得、价廉和高效的疫病防控手段，已在兽医临床得到了广泛应用。本试验利用PEDV SD株免疫产蛋母鸡，制备出抗PEDV的特异性卵黄抗体，经攻毒治疗试验和临床应用，证实具有良好的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2014年9月至2015年6月在安徽省农业科学院畜牧兽医研究所进行。

1.2 主要材料

36周龄产蛋母鸡来自安徽省农业科学院畜牧兽医所试验鸡场，1日龄未吃初乳仔猪购自安徽省巢湖市某猪场，PEDV SD株由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所兽医研究室分离、鉴定、保存，超滤离心管购自millipore公司，弗氏完全佐剂（CFA）和弗氏不完全佐剂（IFA）均购自sigma公司，猪流行性腹泻病毒（PEDV）的抗原快速检测试剂盒（胶体金试剂）购自BioNote公司。

1.3 蛋鸡免疫

取PEDV SD株的第9代Vero细胞培养物（TCID50为10-6.25/0.1 mL）作为免疫原，共免疫产蛋鸡30只，首次免疫，免疫原用CFA乳化，其余用IFA乳化，免疫原和佐剂的比例为1∶1，免疫方式为胸部肌肉多点注射，免疫剂量为1 mL/次，免疫次数为4次，每次免疫间隔为2周。二免后2周开始收蛋测抗体效价。

1.4 抗体效价测定

PEDV SD株的Vero细胞培养物，反复冻融3次，8 000 r/min离心5 min，取上清液，用30 kDa超滤离心管浓缩至100倍作为琼扩抗原，用生理盐水将蛋黄按1∶4稀释，8 000 r/min匀浆2 min，4层纱布过滤后，用生理盐水倍比稀释加到琼扩的孔中，以出现沉淀线的最高稀释度作为抗体效价。

1.5 抗体制备

取抗体效价高于1∶32的蛋黄，用生理盐水将蛋黄按1∶4稀释，8 000 r/min匀浆2 min，4层纱布过滤后，按万分之一的比例加入硫柳汞，并加入青、链霉素各1 000单位/mL，分装后冻存备用。

1.6 人工感染和治疗试验

未吃初乳的仔猪18头，每头猪口服5 mL PEDV SD株第8代Vero细胞培养物，26 h后均出现明显的水样腹泻，将18头发病仔猪分成3组，每组6头，第1组攻毒后26 h和36 h各口服制备的PEDV蛋黄液3 mL，第2组攻毒后26 h口服制备的PEDV蛋黄液3 mL，第3组攻毒后26 h和36 h各口服生理盐水3 mL，连续观察3周。

1.7 临床应用试验

疑似发生PEDV的猪场，经猪流行性腹泻病毒（PEDV）的抗原快速检测试剂盒检测结果呈阳性，发病仔猪间隔10 h口服制备的PEDV蛋黄液3 mL两次，发病未治疗和/或仅使用抗生素治疗的仔猪作为对照组，连续观察3周。

2 结果与分析

2.1 抗体效价

二免后2周测得抗体效价为1∶8，三免后2周测得抗体效价为1∶32，四免后2周测得抗体效价为1∶128，四免后4周测得抗体效价为1∶514，四免后6周测得抗体效价为1∶256，四免后8周测得抗体效价为1∶64，四免后10周测得抗体效价为1∶4。

2.2 人工感染和治疗试验

自安徽省巢湖市某猪场购入刚出生未吃初乳的仔猪18头，每头猪口服5 mL PEDV SD株第9代Vero细胞培养物后18 h，开始出现水样腹泻，26 h后均出现明显的水样腹泻。生理盐水治疗组的6头仔猪在攻毒后42～80 h全部死亡，两次卵黄抗体治疗组在攻毒后40 h仔猪死亡1头，1次卵黄抗体治疗组在攻毒后44 h、48 h、72 h仔猪各死亡1头，见表1。

表1 仔猪攻毒保护试验结果

2.3 临床应用试验

合肥郊区、肥东、广德的3家猪场，发病仔猪临床表现为水样腹泻，肠道出血，仔猪一般在10日龄内死亡，经猪流行性腹泻病毒（PEDV）的抗原快速检测试剂盒检测结果呈阳性，应用制备的PEDV蛋黄液进行治疗，结果显示，PEDV蛋黄液治疗效果显著，相较于对照组，可减少仔猪死亡率分别为67.7个百分点、57.0个百分点和77.5个百分点，具体见表2。

表2 临床应用试验结果

3 讨论

本研究取PEDV SD株的第9代Vero细胞培养物用佐剂乳化后免疫适龄产蛋鸡，三免后2周抗体达到较高效价（琼扩效价为1∶32），四免后4周测得抗体效价最高（琼扩效价为1∶514），至四免后10周抗体效价降至较低水平（琼扩效价为1∶4），维持较高抗体水平（琼扩效价≥1∶32）的时间约为2个月。取抗体效价高于1∶32的蛋黄所制备的卵黄液，用于人工感染后的治疗及临床应用均获得良好的效果。研究结果表明，PEDV SD株作为免疫原免疫产蛋鸡，产生了特异性的高效免疫应答，制备的卵黄抗体可用于PED的针对性防控。

1973年我国上海发生了仔猪急性腹泻，1984年证实病原为PEDV[2]，随后我国各地陆续有PED发生的报道。1995年起，我国开始使用猪流行性腹泻病毒+传染性胃肠炎病毒（PEDV+TGEV）二联灭活苗，很长一段时间内在PED防控方面取得较好的效果。2010年底开始，我国不少地区的很多猪场发生仔猪腹泻，流行面较广，呈暴发性流行，2011—2012年流行面积进一步扩大，疫情继续蔓延，一些地区流行较为严重[3-5]，使用PEDV+TGEV二联灭活苗以及PEDV弱毒疫苗的猪场，也暴发了严重的腹泻病，给我国的养猪业造成了巨大的损失。2013年起，PED的发病出现减弱趋势[6]，但其危害依然存在，猪场一旦暴发猪流行性腹泻，采用对症治疗效果并不理想，用PEDV SD株作为免疫原制备的特异性卵黄抗体，为有效解决当前PED对养猪生产的危害提供了一种可行的手段。

[1]Pensert M B,De Bouck P.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J].Arch Virol,1978,58(3):243-247.

[2]宣华，邢德坤，王殿瀛，等.应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹泻病毒的研究[J].兽医大学学报，1984，4（3）：202-208.

[3]刘孝珍，陈建飞，时洪艳，等.2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析[J].中国预防兽医学报，2012，34（3）：180-183.

[4]蔡汝健，张乐宜，宋长绪.2010—2013年华南地区猪流行性腹泻病流行情况调查及防控效果[J].广东农业科学，2013（14）：104-105.

[5]郭容利，何孔旺，茅爱华，等.2011—2012年我国部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3基因的遗传变异分析[J].畜牧与兽医，2013，45（5）：1-4.

[6]杨汉春.2013年猪病流行情况与2014年流行趋势及防控对策[J].猪业科学，2014（2）：42-43.

（编辑：郭玉翠）

Preparation and Application of Egg Yolk Antibody Against Porcine Epidemic Diarrhea Virus

PAN Xiaocheng,ZHAO Ruihong,SHEN Xuehuai,ZHANG Danjun,HU Xiaomiao, ZHOU Xueli,DAI Yin,HOU Hongyan,QIAN Kun
(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Anhui Academy of Agricultural Science,Hefei 230031,China)

Antibody against porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)was obtained from egg yolk of chickens immunized with PEDV SD strain.After challenge exposures to PEDV,the piglets were treated orally with the egg yolk antibody against PEDV,the experiment showed that the mortality rate was 100 percent in the control group, whereas only 50.0 percent and 16.7 percent in the antibody treatment group for one and two times,respectively. In the naturally infected farms,the mortality rate of treatment group piglets were reduced 67.7 percent,57.0 percent and 77.5 percent,respectively.

porcine epidemic diarrhea virus(PEDV);egg yolk antibody;preparation;application

S858.28

A

1002-1957(2016)03-0119-02

2016-03-09

安徽省农业科学院创新团队（13C0405）；院长青年创新基金（11B0417）；安徽省生猪产业现代农业生产发展资金项目；安徽省生猪产业技术体系项目

潘孝成（1971-），男，安徽霍邱人，助理研究员，博士，主要从事畜禽传染病研究工作.E-mail：pxcpyq@sina.com

钱坤（1964-），男，安徽凤阳人，副研究员，硕士，主要从事农业科研管理工作.E-mail：qiankun581@126.com