陶璇，顾以韧，梁艳，杨雪梅，钟志君，陈晓晖，杨跃奎，曾凯，吕学斌

（1.四川省畜牧科学研究院，四川成都610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，成都610066）

藏猪和杜洛克猪IGF-2基因表达差异及其与肉质性状相关性分析

陶璇1，2，顾以韧1，2，梁艳1，2，杨雪梅1，2，钟志君1，2，陈晓晖1，2，杨跃奎1，2，曾凯1，2，吕学斌1，2

（1.四川省畜牧科学研究院，四川成都610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，成都610066）

为了揭示脂肪型的藏猪和瘦肉型的杜洛克猪胰岛素样生长因子2（IGF-2）基因的表达差异，采用QRT-PCR方法检测了两猪种背最长肌中IGF-2基因在180日龄的表达差异，并分析其与肌纤维面积、肌内脂肪（IMF）含量的相关性。结果表明，180日龄藏猪IGF-2 mRNA表达量显著低于杜洛克猪（P<0.05）。相关性分析结果显示，IGF-2 mRNA表达量与肌纤维面积呈显著正相关（P<0.05），与IMF含量呈显著负相关（P<0.05）。以上结果初步揭示了两猪种在180日龄IGF-2基因表达的品种差异，为深入研究肌纤维生长及IMF沉积的调控机制提供了基础数据。

猪；背最长肌；荧光定量PCR；IGF-2基因；肌纤维面积；肌内脂肪含量

胰岛素样生长因子2（Insulin-like growth factor 2,IGF-2）作为胰岛素样生长因子家族成员之一，在胎儿生长发育、肿瘤细胞增殖、肌肉生长和基因组印迹等方面具有重要的调控作用，是影响猪胴体瘦肉率和背膘厚度的重要候选基因之一[1-3]。研究发现，向背膘更厚的遗传选择会提高血浆IGF-2浓度[4-5]。公猪在15～23周龄之间时，IGF-2浓度与背膘厚呈负相关[6]，预示IGF-2可能是调节脂肪沉积的主要因子之一。

本研究以选育程度低、瘦肉率低的藏猪和选育程度高、瘦肉率高的杜洛克猪为研究对象，采用荧光定量PCR（QRT-PCR）方法研究两猪种180日龄时背最长肌中IGF-2 mRNA的表达差异及其与肉质性状肌纤维面积（Cross sectional area of muscle fiber, CSA）和肌内脂肪（Intramuscular fat,IMF）含量的关系，为研究IGF-2基因影响肌纤维面积、IMF含量的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及采样

试验采用的藏猪、杜洛克猪均由四川省畜牧科学研究院科研试验猪场提供。于2014年5月随机挑选35日龄断奶的藏猪、杜洛克猪各4头，共计8头组建群体，采用相同营养水平和饲喂方式，到180日龄时进行屠宰，屠宰前停食24 h，自由饮水。采集倒数3～4肋骨间对应处的背最长肌样品，一部分用于IMF含量测定，另一部分浸泡于RNA later（Qiagen公司）中，随后投入液氮中保存。

1.2 肉质性状测定

1.2.1 肌纤维面积测定采用KD-2508型切片机（Kedee公司）按照冰冻切片标准制作流程制作背最长肌样品的冰冻切片，苏木精-伊红（Hematoxylin&eosin,H&E）染色后用BK5000型显微成相系统（Optec公司）采集代表性区域图像，通过Motic Images Advanced 3.2显微图像分析软件计算每个样品中100根肌纤维的面积。

1.2.2 肌内脂肪含量测定屠宰后采集倒数3～4肋骨间背最长肌样品10 g左右，样品处理和操作严格按照猪肌肉品质测定技术规范（NY/T 821—2004）进行，采用全自动快速索氏抽提仪（瑞士，Buchi）进行抽提。

1.3 QRT-PCR测定IGF-2 mRNA相对表达量

1.3.1 总RNA提取和反转录肌肉样品的总RNA提取按照mirVana Kit（Life Technologies Corporation, USA）试剂盒的操作说明书完成，并通过Agilent Bioanalyzer 2100对抽提的RNA进行质检，然后使用SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa公司）进行cDNA的合成。

1.3.2 PCR引物的设计与合成引物由Primer premier 5.0程序设计，深圳华大基因科技有限公司合成，信息见表1。

表1 荧光定量RT-PCR目的基因引物的相关信息

1.3.3 QRT-PCR在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad,USA）仪器上进行mRNA荧光定量PCR检测。PCR反应体系为25 μL：12.5 μL SYBR Green q-PCR Super Mix，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2 μL的cDNA模板，RNAase free水9.5 μL。采用两步法进行荧光定量PCR的扩增。PCR循环参数为：95.0℃10 s；95.0℃5 s，60℃30 s，循环40次，PCR扩增后进行熔解曲线分析，温度以0.5℃/30 s的速率从55.0℃缓慢递增到95.0℃。试验样本和阴性对照每个样本重复3次。

1.4 统计与分析

选用肌肉组织中稳定表达的ACTB、TBP和TOP2B为看家基因，运用GeNorm软件计算出看家基因的归一化因子NF值（Normalization factor），以目的基因mRNA的拷贝数（最大拷贝数设为1）与对应样品的NF值的比值表示基因mRNA的相对表达量[7]。采用SigmaPlot 12.5软件对性状指标和基因相对表达量进行t检验，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 肌纤维面积、IMF含量测定

由表2可知，180日龄藏猪、杜洛克猪的肌纤维面积分别为2 221.52、6 351.41 μm2，IMF含量分别为3.08%、2.46%。藏猪肌纤维面积极显著小于杜洛克猪4 129.89 μm2（P<0.01），IMF含量极显著高于杜洛克猪0.62个百分点（P<0.01）。

表2 180日龄藏猪、杜洛克猪的肌纤维面积、IMF含量（n=4）

2.2 IGF-2 mRNA表达量及其与肌纤维面积、IMF含量相关性分析

由图1可知，180日龄藏猪IGF-2 mRNA表达量显著低于杜洛克猪（P<0.05）。对IGF-2 mRNA表达量与肉质性状肌纤维面积、IMF含量的相关性进行分析，结果见表3。IGF-2 mRNA表达量与肌纤维面积呈显著正相关（P<0.05），与IMF含量呈显著负相关（P<0.05）。

图1 6月龄藏猪与杜洛克猪IGF-2基因相对表达量

表3 IGF-2 mRNA表达量与肌纤维面积、IMF含量相关性分析

3 讨论

藏猪是国家级畜禽资源保护品种，IMF含量较高，肉质优良，但生长速度慢，胴体瘦肉率低，属脂肪型猪种；而杜洛克猪IMF含量较低，肉质较差，但生长发育快，饲料利用率高，胴体瘦肉率高，是典型的瘦肉型猪种。本研究结果显示，180日龄藏猪IMF含量极显著高于杜洛克猪（P<0.01），而肌纤维面积极显著低于杜洛克猪（P<0.01），这与藏猪和杜洛克猪的种质特性相一致。

IGF-2具有提高蛋白质合成中氨基酸的利用率并抑制蛋白质降解，从而促进骨细胞和肌肉细胞增殖的作用。研究证明，IGF-2基因对猪肌纤维发育、生长及脂肪的沉积有重要影响，进而影响生长速度、瘦肉率、背膘厚、背最长肌面积[8-12]。本研究结果显示，180日龄藏猪IGF-2 mRNA表达量显著低于杜洛克猪（P<0.05），与肌纤维面积呈显著正相关（P< 0.05），与IMF含量呈显著负相关（P<0.05），说明IGF-2基因能促进肌纤维生长、降低肌内脂肪沉积，与之前报道基本一致。

[1]Florini J R,Magri K A,Ewton D Z,et al."Spontaneous"differentiation of skeletal myoblast is dependent upon autocrine secretion of insulin-like growth factor-II[J].Journal of Biological Chemistry,1991,266:15917-15923.

[2]刘桂兰，蒋思文，熊远著，等.胰岛素样生长因子2的遗传学特征与生物学作用[J].遗传，2002，24（2）：211-213.

[3]吴嫦丽，许继国，吴同山，等.长白和蓝塘猪印记基因IGF2和H19的时空表达研究[J].华南农业大学学报，2013，34（3）：388-392.

[4]Lamberson W R,Sterle J A,Matteri R L.Relationships of serum insulin-like growth f actor-II concent rations to growth, compositional,and reproductive traits of swine[J].Journal of Animal Science,1996,74:1753-1756.

[5]Sterle J A,Cantley T C,Lamberson W R,et al.Effects of recombinant porcine somatotropin on placental size,fetal growth, and IGF-I and IGF-II concentrations in pigs[J].Journal of Animal Science,1995,73:2980-2985.

[6]Owens P C,Gatford K L,Walton P E,et al.The relationship between endogenous insulin-like growth factors and growth in pigs[J].Journal of Animal Science,1999,77(8):2098-2103.

[7]Erkens T,Poucke M V,Vandesompele J,et al.Development of a new set of reference genes for normalization of real-time RTPCR data of porcine backfat and longissimus dorsi muscle,and evaluation with PPARGC1A[J].Bmc Biotechnology,2006,6(1): 41.

[8]Annemieke P,Rattink D J,De K,et al.Fine mapping and imprinting analysis for fatness trait QTLs in pigs[J].Mammalian Genome,2000,11(8):656-661.

[9]Yang G C,Ren J,Guo Y M,et al.Genetic evidence for the origin of an IGF2 quantitative trait nucleotide in Chinese pigs[J]. Animal Genetics,2006,37(2):179-180.

[10]Vykoukalova Z,Knoll A,Dvorak J,et al.New SNPs in the IGF2 gene and association between this gene and backfat thickness and lean meat content in Large White pigs[J].Journal of animal breeding and genetics,2006,123(3):204-207.

[11]虞德兵，何宗亮，张伟峰，等.猪IGF-2基因内含子3变异的遗传效应分析[J].遗传，2008，30（1）：87-93.

[12]虞德兵，熊锴，张宇霞，等.猪IGF2 Intron3 G3072A突变及其在背最长肌中差异表达[J].南京农业大学学报，2010，33（6）：105-109.

（编辑：郭玉翠）

吃素未必有利于环境

【英国《每日邮报》网站12月15日报道】坚持素食未必像你以为的那么有利于环境，事实上，它也许对环境有破坏。

卡内基-梅隆大学的一项研究发现，与某些肉类相比，许多常见蔬菜每卡路里热量需要消耗更多资源，还造成更多的温室气体排放。

虽然研究证实降低体重对环境有积极影响，但研究人员发现，健康的饮食会对环境产生更大影响。

他们研究了食品在从种植、加工和运输到销售、服务和家庭存储的过程中所产生的影响。

研究人员还测量了能源消耗量、蓝色水足迹（水足迹指的是国家、地区或个人在一定时间内消费的产品和服务耗费的水资源，蓝色水足迹指耗费的蓝水资源，蓝水指河流、湖泊、水库、池塘等地表或地下水资源—本报注）和温室气体排放量。

“吃生菜的温室气体排放量是吃培根的三倍，”社会和决策学与工程和公共政策教授保罗·菲什贝克说，“许多常见蔬菜每卡路里热量所需要的资源超过你的想象。与猪肉或鸡肉相比，茄子、芹菜和黄瓜显得特别糟糕。”

研究人员研究了食品供应链，以了解美国的肥胖症与环境的关系。

摄入较少热量和降低体重能减少能源使用量，并使淡水消耗量和温室气体排放量下降9%。

然而，吃得更健康反而加大了对环境的影响。水果、蔬菜、乳制品和海产品造成能源使用量增加38%，同时导致用水量增加10%、温室气体排放量增加6%。

汤姆说：“饮食和环境之间关系复杂，对健康有利的未必有利于环境。政府官员认识到这点很重要，他们将来拟订膳食指南时应牢记这些相互关系。”

（转自参考消息[N]，2015-12-18）

Expression Differences of IGF-2 Gene and Its Correlation Analysis with Meat Quality Traits in Tibet and Duroc Pigs

TAOXuan1，2,GUYiren1，2,LIANGYan1，2,YANGXuemei1，2,ZHONGZhijun1，2, CHENXiaohui1，2,YANGYuekui1，2,ZENGKai1，2,LVXuebin1，2
(1.Sichuan Animal Science Academy,Chengdu 610066,China; 2.Animal Breeding and Genetics Key Laboratory of Sichuan Province,Chengdu 610066,China)

To investigate the differential expression of Insulin-like growth factor 2(IGF-2)gene between Tibet (a fatty,indigenous,Chinese breed)and Duroc(a leaner,Western breed)pigs.The expression differences of IGF-2 gene in longissimus dorsi muscle were measured in two pig breeds at the age of 180 days by using QRT-PCR approach,their correlations with cross sectional area of muscle fiber(CSA)and intramuscular fat(IMF)content were also analyzed.The results showed that the expression level of IGF-2 mRNA in Tibet pigs was significantly lower than that of Duroc pigs at the age of 180 days(P<0.05).The correlation analysis results showed that the expression level of IGF-2 mRNA had significant positive correlation with CSA(P<0.05)and significant negative correlation with IMF content(P<0.05).These results suggested that the mRNA level of IGF-2 gene in longissimus dorsi muscle are different in Tibet and Duroc pigs at the age of 180 days,which provided some data for further study on elucidating the molecular mechanism of growth of muscle fibers and IMF deposition.

pig;longissimus dorsi muscle;QRT-PCR;IGF-2 gene;cross sectional area of muscle fiber;IMF content

S828

A

1002-1957(2016)03-0062-03

2016-04-28

四川省基本科研业务费专项资金（SASA2014A04）；国家生猪产业技术体系-综合试验站（CARS-36）；四川省科技支撑计划（2014NZ0092）；国家现代农业产业技术体系四川创新团队（sccxtd-001）；四川省基本科研业务费专项资金（SASA2013B02）

陶璇（1982-），男，四川金堂人，助理研究员，硕士，主要从事猪遗传育种与繁殖研究.E-mail：taoxuan0106@163.com

吕学斌（1965-），男，研究员，博士，主要从事猪遗传育种研究.E-mail：lvxuebin@21cn.com