迷走神经切断术后艾灸对大鼠胃黏膜相关因子及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响*

2016-12-16向丽婷李燕平

针灸临床杂志 2016年11期

关键词：胃粘膜灌胃艾灸

向丽婷，李飞，刘芳，陈果，向娟，陈瑛，杨舟，于隽，李燕平，彭亮

(湖南中医药大学，湖南长沙 410208)

实验研究

迷走神经切断术后艾灸对大鼠胃黏膜相关因子及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响*

向丽婷，李飞，刘芳，陈果，向娟，陈瑛，杨舟，于隽，李燕平，彭亮△

(湖南中医药大学，湖南长沙 410208)

目的：迷走神经切断后，观察艾灸“足三里”穴对大鼠胃粘膜相关因子以及Bcl-2、Bax蛋白的表达，探讨迷走神经在艾灸足三里穴保护胃粘膜损伤神经通路中的重要作用。方法：依照随机数字表法，将48只健康SD大鼠随机分为4组，每组各12只，分别为：A组：正常对照组；B组:模型组；C组：艾灸+模型组；D组：艾灸+模型+迷走神经切断组。其中D组严格按照手术要求，将迷走神经切断，护理观察3天后，A组进行生理盐水灌胃,B、C、D组进行无水乙醇灌胃造模，1 h后，再进行阿司匹林悬溶液灌胃3天后(用来维持胃粘膜损伤持续状态)，对C、D两组进行艾灸处理。而A、B两组进行假艾灸捆绑处理，每日2次，连续3天。取出血清及胃组织并计算UI,通过相关检测方法检测血清和组织中的NO、PGE2、Bcl-2、Bax蛋白表达情况。结果：①B组胃粘膜损伤指数明显升高(P=0.000)，说明造模成功；与B组比较，C组UI指数明显下降(P=0.001)，说明艾灸能够改善胃粘膜损伤情况，对胃粘膜具有一定的修复作用；②与B组比较，C组血清和组织中NO、PGE2的含量明显升高(P<0.01)，与C组比较，D组血清和组织中NO、PGE2的含量明显降低(P<0.01)；③与B组比较，C组Bax蛋白表达明显下降(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达上升(P<0.01)，AI比值升高(P<0.01)；与C组比较，D组Bax蛋白表达明显上升(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达明显下降(P<0.01)，AI比值升高(P<0.01)，说明艾灸对胃黏膜细胞具有延缓凋亡的作用。结论：艾灸对胃粘膜具有一定的保护作用，而迷走神经切断后能够明显降低艾灸对胃黏膜的保护作用，说明迷走神经通路的完整与否是艾灸保护胃粘膜的重要条件。

迷走神经切断；艾灸；足三里；胃粘膜损伤

胃粘膜损伤是临床多发的致病因素之一，是导致胃溃疡的主要病理生理学环节,是由于理化因素、细菌或其毒素刺激等多种因素所引起的胃粘膜炎症、糜烂和出血的统称，表现为胃粘膜充血、糜烂、坏死、脱落、浅表溃疡形成，是全球性多发病之一。目前研究认为：该病主要是由于针对胃粘膜的侵袭因素与保护因素之间失去平衡所致。因此，目前，对胃粘膜损伤的处理，不仅要减少侵袭因子损坏的同时，更应加强保护因子的防御功能。而目前有大量研究证明：艾灸预处理对胃黏膜具有一定的保护作用[1-3],其保护机制可能是其激发机体产生内源性保护物质的同时，又启动了一系列抗炎、抗氧化、抑制凋亡等抗损伤和胃黏膜细胞增殖及胃黏膜重建等保护效应[4-8]。而前期有研究已经证实：艾灸预处理对胃黏膜的保护作用部分受到迷走神经调节的影响，迷走神经通路可能是艾灸对胃粘膜损伤与保护因子表达的重要途径之一[9]。本实验在前期研究的基础上，继续探讨迷走神经切断术后艾灸对大鼠胃黏膜相关因子及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级SD大鼠48只，雌雄各半，体质量180～200 g，月龄3～4个月，由湖南中医药大学动物实验中心提供[动物合格证号:CXK(湘)2011-0003]，饲养于湖南中医药大学3号实验动物房，其饲养环境温度22℃～25℃，湿度50%～70%，动物自由摄食及饮水，自然采光。将48只健康SD大鼠按照随机数字表法随机分为4组，每组12只，分别为：A组：正常对照组；B组:模型组；C组：艾灸+模型组；D组：艾灸+模型+迷走神经切断组。

1.2 主要仪器与试剂

鼠板、电子称、常规手术器械、玻璃分针、4 mm艾条及自制艾灸架、隔热板、体温计、放大镜、BP管、一次性手套、绑带、一次性负压采血针、离心机、滤纸、移液枪、-20℃冰箱、-80℃冰箱。10%甲醛溶液、生理盐水、无水乙醇、10%水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)、碘伏、青霉素粉(由湖南中医药大学第一附属医院提供)、ELISA检测试剂盒、westem-blot检测试剂盒。

1.3 实验方法

①将48只SD大鼠雌雄分笼，适应性饲养1周后，用以适应环境；②D组大鼠禁食不禁水24 h后，对其进行迷走神经切断术，术后护理，观察；③3天后，各组大鼠禁食不禁水24 h后，对需要造模的B、C、D各组进行无水乙醇灌胃造模，1 h后，用阿司匹林悬溶液进行灌胃(用以防止大鼠胃粘膜损伤的自愈性)，A组进行生理盐水灌胃处理；④3天后对C、D组进行艾灸处理，A、B组进行假艾灸捆绑处理，每日2次，共3天；⑤艾灸处理结束后，各组大鼠禁食不禁水24 h后，腹腔麻醉，进行腹主动脉取血、取胃组织，最后进行指标检测，分析数据。

1.3.1 迷走神经切断术参照Mordes膈下迷走神经切断方法。①将SD大鼠适应性喂养1周后，D组大鼠术前禁食不禁水24 h,称重，腹腔麻醉(10%水合氯醛0.35 ml/100 g)。②备皮，常规碘伏消毒，沿腹正中线打开腹腔，在距贲门5 mm处的食管前后壁,用玻璃分针分离出迷走神经前后支，并将其切断。③于手术剖面撒少量青霉素粉，并逐层缝合切口。④D组大鼠按16 U/只肌肉注射青霉素防止感染，连续注射3天，并适时观察大鼠切口愈合情况，酌情加减青霉素注射时间。⑤术后，分笼饲养于环境温度为22℃～25℃，湿度50%～70%动物房内，恢复正常饮食，自然采光。伤口愈合较好后进行造模[10]。

1.3.2 急性胃粘膜损伤模型采用无水乙醇灌胃法[11]。①D组大鼠迷走神经切断并观察3天后，各组大鼠禁食不禁水24 h。②采用无水乙醇及阿司匹林混悬液灌胃法造成大鼠胃黏膜损伤模型(预实验中已证实其可行性)：B、C、D各组大鼠进行无水乙醇灌胃，A组采用生理盐水灌胃(其灌胃剂量和方法与其它各组一致),先采用普通的注射器针头,按乙醇灌胃剂量0.6 ml/100 g吸取相应的剂量，再换为直形灌胃针采用普通灌胃法进行灌胃1次。③1 h后按照2 ml/只阿司匹林溶液进行灌胃，用以预防大鼠胃粘膜损伤自愈性(连续灌胃3天)。④3天后，各组大鼠禁食不禁水24 h后开始艾灸处理。

1.4 艾灸处理

1.4.1 穴位定位参照“十五”国家规划统编教材《实验针灸学》[12]用动物穴位定位法取大鼠双侧足三里即大鼠膝关节后外侧,在腓骨小头下约5 mm处。

1.4.2 艾灸方法所有大鼠以俯卧位固定于鼠板上，其中A、B两组只绑不灸，C、D两组大鼠取双侧足三里穴，定位剪毛，将直径为3 mm的有孔隔热贴贴于穴位上,将4 mm细艾条用自制小型艾灸支架固定,对准穴位,距离穴位约0.5 cm处点燃施灸,灸处局部温度控制在42℃左右(将体温计放在艾条所对皮肤附近，测量温度),艾灸时间30 min/次,每天2次，连续治疗3天，每天处理后松绑,回笼正常饲养，直至取材。

1.5 标本采集与处理

1.5.1 采取血清并检测大鼠艾灸处理3天后，禁食不禁水24 h，腹腔麻醉(10%水合氯醛0.35 ml/100 g)剖腹后，将胃的幽门部和贲门部用止血钳结扎，并用纱布分离出腹主动脉，快速用一次性负压采血针从腹主动脉采血5 ml，于37℃恒温水浴箱静置30 min，-4℃低温离心，3 000 r/min，离心15 min后用移液枪提取上清液置于-80℃冰箱保存，并采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测NO、PGE2。

1.5.2 取胃组织 ①采血后在两结扎线的两端切断食道及十二指肠，摘下全胃,并沿胃大弯剪开,用冰生理盐水冲洗干净，平铺于冰盒上，用放大镜，肉眼观察，并计算胃粘膜损伤指数(UI)。②取胃窦部一小块组织(5 mm×5 mm), 放在BP管内，并用10%甲醛溶液固定1周，用石蜡包埋的方法,连续切片(厚度4 mm)、烤片、常规脱蜡。用于组织形态学观察。采用western-blot方法检测胃黏膜Bcl-2、Bax蛋白表达。①取50～100 mg组织冰上剪碎，用预冷的PBS洗涤2次离心弃去PBS；②加入0.25～0.5 ml预冷RIPA裂解缓冲液；③4℃用玻璃匀浆器匀浆20～40次，直到95%的细胞被破碎，冰浴中放置半小时，并每隔10 min在漩涡混合仪上振荡30 s；④离心(4℃，12 000 rpm，15 min)，取上清液至新的离心管中，即得组织总蛋白产物；⑤若所得蛋白产物较为粘稠，95℃加热5 min，再迅速冰浴5 min，再如前法离心取上清液，分装后放-80℃保存。严格按照western-blot方法检测胃黏膜Bcl-2、Bax蛋白表达。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 各组大鼠胃粘膜损伤指数(UI)的影响

表1结果表明：与A组比较，B组胃黏膜表面存在粒数较多且明显的充血、水肿、出血点以及溃疡点,胃黏膜损伤造模成功；与B组比较，C组的胃粘膜表面损伤情况明显好转(P=0.001)，说明艾灸处理可以明显降低胃粘膜损伤指数；与C组比较，D组胃粘膜损伤情况较为严重(P=0.007)，说明艾灸对胃粘膜保护作用，受到了迷走神经的影响。

表1 各组大鼠胃粘膜损伤指数(UI)的比较

注：与A组比较，■P<0.01;与B组比较，*P<0.01;与C组比较，**P<0.01

2.2 各组大鼠血清与组织中NO、PGE2含量的比较

表2结果表明：造模后的B组大鼠胃粘膜血清和组织当中的NO、PGE2含量明显降低，说明大鼠在乙醇、阿司匹林悬溶液灌胃后，大鼠的胃粘膜防御功能受到抑制;与B组比较，C组大鼠胃粘膜血清和组织当中的NO、PGE2含量明显升高(血清：PNO=0.000，PPGE2=0.000；组织：PNO=0.000，PPGE2=0.000)，说明艾灸能够增加胃粘膜血清和组织当中的NO、PGE2含量，从而对胃粘膜起到一定的保护作用；C组和D组比较，D组胃粘膜血清和组织当中的NO、PGE2含量下降(血清：PNO=0.000，PPGE2=0.000；组织：PNO=0.009，PPGE2=0.000)，说明艾灸对胃粘膜的保护作用，是基于神经通路完整的基础上才能完成的，迷走神经在艾灸对胃粘膜保护作用中起到了重要的调节作用。

表2 各组大鼠血清与组织中NO、PGE2的比较

注：与A组比较，■P<0.01;与B组比较，△P<0.01,★P>0.05；与C组比较,*P<0.01

2.3 各组大鼠黏膜组织中Bcl-2、Bax表达的比较

图1、表3结果表明，与B组比较，C组胃粘膜组织中的Bax表达明显下降(P=0.000)，Bcl-2表达明显上升(P=0.000)，AI比值上升(P=0.000)，表明艾灸能够促进胃粘膜组织中的Bcl-2的表达，而对Bax表达具有一定抑制作用。证明了艾灸能够延缓细胞凋亡，起到重要作用。与C组比较，D组中的Bax表达有所增高(P=0.000)，Bcl-2的表达降低(P=0.000)，AI比值也降低(P=0.000)，说明迷走神经参与了艾灸对胃粘膜组织中的Bcl-2、Bax蛋白的表达，迷走神经切断后，能够加速细胞凋亡作用。

表3 各组大鼠黏膜组织中Bcl-2、Bax

注：与A组比较，■P<0.01;与B组比较，*P<0.01,★P>0.05;与C组比较,△P<0.01

3 讨论

艾灸作为一种中国传统特色疗法，具有绿色环保、无污染的特点，目前大量临床研究证实[13-16]，艾灸除了本身具有行气止痛、通经活络、温经散寒、调节机体的脏腑功能以外，还具有抗菌消炎、镇痛和调节机体的免疫功能等作用。而艾灸对急性溃疡胃黏膜损伤保护作用的认识从胃电、胃运动、胃分泌、细胞保护及免疫调节机制等方面进行了研究[17-18]。胃黏膜损伤的主要症状和特征表现是属于祖国医学中“胃脘痛”“痞证”范畴,又与“吞酸”“胁痛”等病症具有密切关系。在中医学当中认为胃属阳土,喜润恶燥,为五脏六腑之大源,乃多气多血之腑,主受纳腐熟水谷,其气以和降为顺。《四穴总歌》载：“肚腹三里留。”说明足三里是足阳明胃经上的合穴，足三里作为胃经的合穴，它具有调理脾胃、补中益气、通经活络、疏风化湿、扶正祛邪之功能。能够通过刺激这个穴位激发阳明经气，循经络传导直达到脾胃，从而调整脏腑功能失调，这种调整作用能够防止脾胃的不良影响，保护脾胃。孙世晓等[19]通过艾灸足三里穴对猫胃运动的影响,结果表明艾灸能够增强空腹实验动物胃运动效应,同时也认为迷走神经是艾灸增强对胃黏膜保护效应的重要传出信号途径。

目前有大量的研究表明：胃黏膜受到来自外界各种应激作用的影响可致胃粘膜损伤，在损伤部位的周围会释放大量的细胞因子，细胞因子之间会相互产生效应，对细胞的增殖和凋亡发挥着调节作用。同时也对溃疡的发生、发展、修复过程产生广泛的影响。主要包括：NO、PGE2的含量以及Bcl-2、Bax蛋白的表达。

NO是一种具有广泛生物效应的小分子物质，是人体当中一种重要的炎性介质。在生理状态下，NO作为内皮舒张因子的一种，胃粘膜血管内皮细胞和神经细胞可以产生少量的NO，可通过舒张使胃粘膜血管平滑机来改善胃粘膜的血供环境和黏液的分泌，具有保护胃黏膜的作用。在病理状态下，过量的NO可能会通过引起正常基因发生冲突或者变成毒性更大的羟自由基和过氧硝基阴离子介导并导致细胞膜脂质过氧化物损伤和细胞毒性[20]。大量研究表明，PGE2与胃粘膜有着非常密切的联系，且这种保护作用已经被大量的实验证实，认为PGE2不仅能够增加胃粘膜的血流量，促进细胞分裂增殖，同时具有很强的抑制胃酸、胃蛋白酶原分泌作用，对胃粘膜损伤具有防治作用。有研究观察电针足三里对家兔胃粘膜损伤后的细胞保护作用与PGE2有关，其结果显示，电针足三里对胃粘膜损伤后的细胞保护作用可能的机理是由于提高胃液、胃粘膜中的PGE2含量[21]。本实验证明了艾灸能够使胃粘膜血清与组织中的NO、PGE2含量增加，且迷走神经切断后将会影响到胃粘膜血清与组织中NO、PGE2含量的增加程度，因而表明，艾灸对胃粘膜的保护和修复作用与NO、PGE2有关，并且这一保护和修复作用受到了迷走神经的调节。

Bcl-2/Bax蛋白是抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，对细胞的生存和凋亡起着重要的作用[21]，Bcl-2与Bax形成的异源二聚体使彼此的抗凋亡活性相互抵消，因而当细胞受到细胞内外各种刺激后，细胞内两者之间的相对比例决定了细胞凋亡发生与否，当Bcl-2表达增多时，Bax减少，Bcl-2/Bax比例增加，则会抑制细胞凋亡；相反，则促进细胞凋亡。本实验研究表明，无水乙醇和阿司匹林悬溶液灌胃后，可以使抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，而促凋亡蛋白Bax表达上升。而当艾灸足三里穴后，C组抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显上升，促凋亡蛋白Bax表达明显下降。说明艾灸能够增加凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制促凋亡蛋白Bax表达。

迷走神经(vagus)共含有感觉、运动和副交感神经纤维，支配着呼吸、消化两个系统的绝大部分器官以及心脏的感觉、运动以及腺体的分泌。所以迷走神经损伤可引起循环、消化和呼吸系统功能失调。其中副交感节前纤维受到了迷走神经背核(DMV)支配，因此被认为是一个重要的内脏运动核团，它广泛的被认为是调节胃部功能最基本核团之一[22-23]。目前有形态学研究认为,支配胃的副交感神经大部分都是来自迷走神经背核，只有少部分是来自疑核，而且，在疑核中，含有大量的乙酰胆碱、儿茶酚胺等相关递质和受体，其内也可发现神经-体液回路，由此可见，它们一同参与了迷走神经背核对胃部功能活动的调节[23]。本实验通过切断胃迷走神经，观察艾灸足三里对胃粘膜损伤保护和修复作用，结果表明，艾灸能够降低大鼠胃粘膜损伤情况，而且这种能够降低胃粘膜损伤的作用，在一定程度上，受到了迷走神经的调节影响。同时艾灸能够增加血清和胃组织中的NO、PGE2的含量，还能使Bcl-2蛋白的表达增强，Bax蛋白的表达减少，但是迷走神经切断后，这些胃粘膜相关因子和蛋白的表达都会受到影响，说明艾灸对胃黏膜的保护修复作用受到了迷走神经的调节。因此笔者认为：艾灸足三里对胃粘膜损伤修复和保护机制可能与艾灸足三里所产生的保护信息，通过腓总神经传入到中枢，经孤束核整合信息以后，通过迷走神经传出，从而对胃粘膜起着一定的保护作用有关，因而，迷走神经的完整与否在艾灸足三里对胃粘膜损伤修复和保护作用中具有很重要的意义。

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