王媛媛　马飞祥　李凤英　王怡诺　薛培凤（内蒙古医科大学药学院　呼和浩特　010110）

在线色谱联用技术检测天然产物抗氧化活性的研究进展△

王媛媛马飞祥李凤英王怡诺薛培凤*（内蒙古医科大学药学院呼和浩特010110）

大量研究表明自由基损伤与肿瘤、糖尿病、心血管系统疾病等多种疾病的发生有密切关系，因此快速发现天然产物中抗氧化活性成分对于阐明药物的作用原理、疾病的发病机制和新药创制具有重要意义。本文主要介绍了HPLC-DPPH法、HPLC-CL法、HPLC-ABTS+法等一系列在线色谱法的原理及其在测定抗氧化能力中的应用，阐述了近年来在线色谱在检测天然产物抗氧化活性方面的研究。

在线色谱 检测 抗氧化活性

抗氧化剂包括人造抗氧化剂和天然抗氧化剂。20世纪80年代，鉴于人造抗氧化剂的安全性饱受争议，人们越来越倾向于开发使用天然抗氧化剂。草药、水果和蔬菜中具有抗氧化的天然成分用作食品、化妆品和药品已成为近年来的研究热点［1］。因此，寻求一种行之有效的检测抗氧化活性的方法，对食品、化妆品和药品抗氧化活性的快速测定等都具有重要的意义。就目前的研究进展而言，抗氧化方法主要包括两大类，即传统抗氧化检测方法和在线抗氧化检测方法。

1　抗氧化活性的传统检测方法

传统的植物天然抗氧化活性成分通常采用先提取、分离、鉴定各种成分后再分别对各成分进行抗氧化活性测定［2］。已经使用的检测抗氧化活性的方法，例如DPPH、ABTS、CL等，只能对物质总体的抗氧化能力进行检测，不能确定物质中何种化合物具有抗氧化能力以及进行定量分析，只有在对某种化合物进行分离纯化后才能测定。传统的对单一组分的抗氧化剂进行提取分离时易导致化合物抗氧化能力的改变，且操作工艺烦琐。多年来，以这样的方法也检测出了一些抗氧化成分，但这些方法往往难以在分离过程中选定筛选目标，显然效率较低。如下对一些检测抗氧化活性的传统方法进行简要概述。

1.1DPPH法：DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一种人工合成的、以氮为中心的、稳定的自由基。由于DPPH溶液在最适波长517nm处有最大吸收峰，当有抗氧化活性成分存在时，可以与DPPH的孤对电子配对，而使其吸光度降低，其降低的程度与待测物质的抗氧化能力成正比，故该法不仅能够通过吸收度的降低程度评价物质的抗氧化能力，还能够进行定量分析。但在评价成分复杂提取物的抗氧化能力时，该法最大的不足在于只能检测出提取物总体的抗氧化能力，无法获知其中某一单体化合物的抗氧化活性，只有再经分离纯化才可确定。然而，一些化合物会由于在分离纯化过程中的分解作用而导致活性发生变化，不能很准确地评价待测物质的抗氧化能力。

1.2ABTS＋·法：ABTS化学名为2，2'-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），是近年来应用频率较高的一种用于检测抗氧化活性的还原型无色物质。其通过与K2S208、Mn02、ABAP、H202、过硫酸铵作用，导致被氧化成蓝绿色的自由基阳离子ABTS＋·。该法最早由Miller于1993年提出［3］，由于ABTS＋·在734nm处有特征吸收峰，当具有供氢能力的抗氧化剂与之反应时，会使其在734nm处的吸光值发生急剧变化，根据其变化程度的大小评价待测物质的抗氧化能力。有时，为了比较多种抗氧化剂的活性，通常会将活性抗氧化物质与含trolox（6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸）的标准抗氧化剂分别与ABTS＋·作用，测定结果以TEAC值作为指标，即TEAC为被测抗氧化剂与标准抗氧化剂清除ABTS＋·能力的比值，所以ABTS＋·法也被称为TEAC法。相对于抗氧化能力的体内检测方法，该法具有设备简单、经费消耗少、简便、迅速等优点。但由于ABTS＋·也可能会与任何羟基化的芳香族化合物发生反应，导致其专一性差，高估被测物质的抗氧化能力。

1.3化学发光法：化学发光（CL）法的基本原理是发光试剂能被活性自由基氧化，生成的激发态氧化产物会伴随着能量衰减以发出光子的形式回到基态。当待测物质中含有抗氧化剂时，抗氧化剂会清除活性自由基，使原本的发光强度降低［4］。利用仪器对清除前后吸光值予以检测，评价待测物的抗氧化能力。除此之外，该技术亦可适用于生物体液的抗氧化活性分析［5］，具有灵敏度高、线性范围宽、分析能力强等特点。

2　抗氧化活性的在线色谱联用检测技术

近些年来，随着色谱技术的发展，研究者们建立了各种在线检测抗氧化活性的色谱联用技术，主要是将各种具有分离功能的色谱技术与抗氧化筛选技术相结合，旨在分离的同时实现化合物的在线鉴定与定量分析，消除了传统方法先分离、再测活的烦琐过程。此法与离线检测方法相比具有自动化、稳定化、快速化、规范化等优点［6］。以下对近年来各种在线色谱检测抗氧化活性的原理及应用简单介绍。

2.1结合DPPH检测抗氧化活性的方法

2.1.1HPLC-UV-DPPH法：HPLC-DPPH法利用色谱柱对复杂成分进行分离后与DPPH直接相连，选定516nm作为检测波长，由于具有抗氧化能力的活性物质能够捕获DPPH的孤对电子而使得原有的峰面积下降甚至表现为倒峰，其倒峰面积与待测物质清除DPPH的能力有一定的关系，该技术快速、高效、操作简单，实现了见“图”识“效”的作用，不失为一种快速检测天然产物中抗氧化成分的重要手段。目前，国内已有诸多学者利用该技术手段对某些天然药物进行抗氧化活性的在线筛选。如王小淞等［7］通过结合紫外检测器建立起的HPLC-UV-DPPH法对黄芩根、茎、叶提取物的抗氧化活性进行在线检测；实验结果表明：黄芩根、茎、叶部位的提取物均可作为一种很好的抗氧化剂，但所含的抗氧化活性成分及含量有较大差异，故可以此评价黄芩各有效部位抗氧化能力。柳艳等［8］也利用该技术对植物中多酚类成分进行了抗氧化活性的研究，结果显示：HPLC-UVDPPH流动注射在线色谱联用技术可以实现对多组分植物化学物抗氧化能力的高通量筛选。邢航等［9］通过此技术证实了葡萄酒中也含有多种抗氧化活性物质。Shanshan Tong等［10～11］利用该方法以水飞蓟素为研究对象进行抗氧化活性的在线检测。Zong-Quan 0u［12］也运用该法提取出了苦菜叶中的抗氧化活性物质。以上实验结果均表明该法能够实现对抗氧化活性成分的在线检测分析，尤其是在比较中药各有效部位的提取物的抗氧化能力大小方面有很好的应用前景。

2.1.2HPLC-DAD-DPPH法：HPLC-DAD-DPPH法是目前检测天然植物中抗氧化活性成分应用较多的联用技术之一。如张作法等［13］采用活性自由基与HPLC-DAD联用，首次对桑枝中的主要抗氧化活性成分进行测定，并比较其在不同桑枝品种中的含量，为深度开发桑枝的药效打下坚实的基础。

其他学者也使用此方法进行了相关性地研究，如王春鹏等［14］，建立HPLC-DAD-DPPH甲醇枸橼酸在线抗氧化活性指纹图谱体系，筛选出金银花抗氧化作用的有效组分及检测其抗氧化能力的强弱，并基于此对不同产地金银花进行质量评价。此项实验结论指出此方法简便可行，基于活性整合指纹图谱筛选出药材中的抗氧化活性成分，在全面有效地评价中药质量的道路上迈出了坚实的一步。

2.1.3HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH法：王虹等［1］的研究在HPLCDPPH法的基础上，结合ESI-T0F/MS进行分析，以茶叶提取物为研究对象，建立一种适用于天然产物提取物中抗氧化活性成分快速筛选与鉴定的方法，填补了传统方法中无法实现某一单体化合物快速检测其抗氧化活性的空白。同时，耿丹丹等［15］在HPLC-DAD-DPPH法的基础上通过结合质谱检测器对丹参和康定鼠尾草中的天然抗氧化活性成分进行快速筛选，鉴定出其活性化合物的具体结构。

这两项实验结果都表明该技术操作简便，重复性好，与传统的天然产物中复杂成分的分离与鉴别模式相比，该联用技术能够同时实现对复杂化合物中抗氧化活性成分的鉴定与定量分析，提高了工作效率。

2.2结合ABTS+·检测抗氧化活性的方法

2.2.1HPLC-UV-ABTS+·法：在线HPLC-UV-ABTS+·检测抗氧化活性成分的方法是将高效液相色谱、紫外检测器与检测清除自由基的ABTS+·试剂检测器连接，在高效液相色谱仪分离组分的同时实现了对抗氧化活性成分的筛选，提高了检测效率。高翔等［3］利用HPLC在线检测消癌平注射液对ABTS+·的清除能力，探究其抗氧化活性的物质基础。研究结果表明该中药制剂中的酚酸类物质对ABTS+·有较强的清除作用，能够实现对传统中药制剂抗氧化活性组分的快速检测。耿雪飞［16］和裴世春等［17］也利用该在线色谱法实现了对细叶杜香叶中抗氧化活性成分的测定。基于此，我们认为，该在线色谱联用技术能够一改传统的筛选方法，有效地提高天然药物中抗氧化活性物质的筛选效率。

2.2.2HPLC-DAD-ABTS+·法：HPLC--DAD-ABTS+·在线检测法是一种简便快捷、不需要对复杂样品进行分离纯化的检测抗氧化活性成分的方法，能够对复杂混合物中清除自由基的活性成分进行分离以及在线测定。王宇卿等［18］学者就是采用该法完成了对生脉散和益气复脉粉针清除ABTS+的活性成分的在线检测，并比较了两者体外抗氧化活性成分的含量。

2.3结合CL检测抗氧化活性的方法

2.3.1HPLC-UV-CL法：CL与具有高效分离特性的HPLC相连，采用紫外分光光度计进行检测，使之成为一种有效的痕量分析技术。近年来，HPLC-CL联用法发展迅速，已成功地运用于黄酮、多酚、儿茶酚胺、芳香族化合物等的检测。朱卉等［19］采用该技术已成功检测出消癌平注射液中活性组分酚酸类物质对H202和0·2-自由基的清除能力，并结合质谱对其活性成分进行鉴别。通过以上介绍得出：HPLC-UV-CL在线联用技术使用简单、高效，可实现对中药注射液中抗氧化活性成分的在线筛选。

2.3.2HPLC-DAD-CL法：LI Yi等［20］利用HPLC-DAD-CL在线检测冠心宁（GXN）注射液的主成分丹参和川芎的抗氧化活性。通过优化分析条件，对来自14个生产批次的冠心宁注射液的15种酚酸的H202抑制速率进行测定。结果显示：15种酚酸均具有抗氧化活性且丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸是冠心宁注射液（25.82%～51.19%）抗氧化的最主要活性成分，同时阐明了该中药制剂的抗氧化作用机制及进行质控分析。与传统方法相比，此项研究表明HPLC-DAD-CL在线联用技术具有使用简便、快捷和低成本等优点，可用于天然产物中抗氧化活性成分的快速筛选。

2.3.3HPLC-UV-CL法：陈乃东［21］与陈存武［22］等拟从霍山石斛抗氧化活性入手，采用HPLC-UV-CL联用法对霍山石斛中总生物碱提取物的抗氧化能力进行在线测定以便快速发现存在于霍山石斛中的抗氧化活性物质，为后续的抗氧化活性物质的定向分离、霍山石斛的谱效关系及临床应用提供理论依据，为探讨新的中药质量评价模式提供参考。最终的实验结果指出采用HPLCUV-CL在线测定方法，以校正清除率为评价指标，可从含有结构类似物的中药中快速发现抗氧化活性物质；然而，对于化学结构及消光系数相差较大的组分，峰面积相同的两个组分，其代表的物质含量相差较大，以峰面积大小代表不同物质含量，误差较大，导致校正抑制率评价抗氧化活性误差较大。因此，在测定结构、消光系数相差较大的化合物抗氧化活性时具有一定的局限性［21～22］。

2.4CE-MS在线预浓缩检测抗氧化活性方法：近几年，因酚酸类化合物对氧化应激能产生防御作用，对其的研究引起了广泛的关注。而毛细管电泳和质谱检测器联用（CE-MS）作为一种有效的可用于分离中性和带电荷的化合物的分离工具，具有定性分析化合物结构信息的独特优势。如学者王文明［23］等的实验采用CE-MS在线预浓缩方法率先对丹参酚酸类化合物中4种亲水活性成分进行定性定量测定，成功地评价了其抗氧化能力。

尽管CE-MS在分析领域已获得广泛的应用，但与HPLCMS相比，CE-MS仍然存在检测灵敏度偏低的缺陷。因此，建立CE-MS在线预浓缩技术，降低检测限的方法已成为研究重点。目前，已有少数几种改进CE-MS灵敏度的方法，其中样品堆积技术是应用最广泛的一种。近年来的研究证明了在线联用HPLC能够有效地清除自由基活性，但国内未见CE-MS测定酚酸类抗氧化活性的方法［23］。

2.5光纤传感微量样品羟自由基检测抗氧化活性方法：羟自由基（·0H）是一种氧化能力很强的活性自由基，可以氧化糖类、脂类、蛋白质等生物大分子，导致它们的化学结构遭到破坏。因此，加强对自由基清除的研究势在必行。古海妮萨·麦合木提［24］等采用Mn2+-H202-EBT方法，通过前期对反应体系吸光度的检测，选定560nm作为最适检测波长，对新疆葡萄树伤流液、金银花茶、罗布麻茶、茉莉茶和竹叶茶进行研究。其原理基于类似芬顿（Fenton）反应的化学反应，主要方程式为：Mn2++H202→Mn3++·0H+ 0H-，当向反应体系（Mn2+-EBT）加入H202时，生成的·0H能够迅速氧化分解EBT与Mn2+反应生成的螯合物，使其560nm处的吸光度迅速下降，从而可间接地检测出羟自由基（·0H）的产生量。而当有抗氧化剂存在时，它会抑制或者延缓螯合物的分解，从而对其待测物质的抗氧化能力进行评价。此法利用光纤作为传输通道，具有光信息传输损耗低、传输量大、不易受外界干扰等特点，并弥补了现在仪器以及传统方法在测定物质抗氧化活性方面的不足且所需样品量少、可连续观察吸光度变化。

3　总结与展望

近年来建立的快速、高效、多系统联用的在线色谱检测抗氧化活性的方法同以往的方法相比，在技术上有了很大的创新，能够在分离的同时进行活性测定，并在不同的药物、植物或复方制剂的抗氧化活性检测中得到验证。但也有不足之处，大多数实验研究在检测抗氧化活性方面的试剂仅仅局限于 ABTS、DPPH。未来，我们需要探索出更多的检测试剂，以便能够更快、更好地对天然药物及复方制剂进行检测。

今后，我们应该努力开发及改进现有的在线色谱抗氧化活性检测方法，建立更快速、直观的在线抗氧化活性检测及评价方法。以便发现天然产物中有效的抗氧化成分，推动中医药事业发展。

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R285

A

1672-8351（2016）09-0123-03

内蒙古自然科学基金（2015MS0823）；内蒙古医科大学实验室开放基金（2016ZN01）。