张玉峰，刘莹莹，李丛胜，毕艳孟，申磊

（1.廊坊师范学院生命科学学院，河北廊坊065000；2.中国农业大学资源与环境学院，北京100193）

河北地区蚯蚓种群遗传多样性分析

张玉峰1，刘莹莹1，李丛胜1，毕艳孟2，申磊1

（1.廊坊师范学院生命科学学院，河北廊坊065000；2.中国农业大学资源与环境学院，北京100193）

为了探讨蚯蚓遗传多样性与土壤环境的关系，2015年6～10月在河北地区进行蚯蚓资源调查和样品采集，利用PCR技术扩增线粒体基因16S rDNA、ND1序列，分析了该区蚯蚓优势种类天锡杜拉蚓（Drawida gisti）的遗传多样性。结果表明：来自河北23个采集点的研究样本，16S、ND1全部DNA序列的平均单倍型多样性分别为0.76和0.64，平均核苷酸多样性分别为0.042和0.039，群体间平均遗传距离分别为0.045和0.054。土壤性质显著影响种群的遗传变异水平。

蚯蚓；天锡杜拉蚓；遗传多样性；土壤性质；河北地区

蚯蚓为大型土壤动物，在土壤的许多理化过程中发挥着重要作用，如，松动土壤，增加土壤的通气性和持水能力，促进土壤有机质的合成与分解。近些年，有关陆栖寡毛类动物的分子生态学研究较少，King等[3]采用AFLP技术研究了英国正蚓科蚯蚓潜在的物种多样性，证明地理隔离对促进新种的形成具有重要影响；Buckley等[4]使用16S和28S rRNA对新西兰环毛蚓的系统发育关系进行了分析，并结合新西兰地质演化史上的一系列重大地质事件，推断了蚯蚓物种群间的遗传分化时间以及地质事件对生物多样性的影响。在我国，有关土壤动物分子生态学的研究鲜有报道[5～7]。天锡杜拉蚓（Drawida gisti）属寡毛纲（Oligochaeta）链胃科（Moniligastridae）杜拉蚓属（Drawdia），是我国一种常见的浅居型（epi-endogeic）蚯蚓，经常活动于土壤表层，偏爱生境为农家菜园和玉米地[1]。天锡杜拉蚓在我国分布范围广泛，吉林、安徽、湖北、江苏等地均有分布[2]。2015年6～10月在河北地区进行蚯蚓样本的野外采集时，亦发现天锡杜拉蚓为该地区的优势种类。作者通过线粒体基因片段分析了天锡杜拉蚓的遗传多样性，并探究了土壤理化性质对其种群遗传多样性的影响，以证明蚯蚓多样性对土壤环境的依赖性。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

河北省地处华北平原，毗邻内蒙古高原，东临渤海，西望太行山；区域内环绕京、津两大城市，东北

部与辽宁省交界，南部、东南部分别与河南和山东两省接壤；地势由西北向东南倾斜，地貌类型主要为平原、山地、高原等，土壤类型主要有褐土和潮土。该区气候条件较好，四季分明，雨热同期，属于典型的温带大陆性季风气候；气温分布特征呈西、南高，东、北低；年降水量总趋势是东南部地区多于西北部地区[8]。本研究的蚯蚓样品采集点主要分布在平原地区，共23个（表1）。

表1 各研究地点的地理位置与土壤养分含量Table1 Geographic location and content of soil nutrient in each site

1.2 试验材料

蚯蚓分布的主要生境为农田、果园、潮湿的枯枝落叶层等。在每采集点，均采用五点法取样，样方大小为50 cm（长）×50 cm（宽）×20 cm（深），利用挖掘法采集蚯蚓。依据《中国陆栖蚯蚓》[2]进行蚯蚓的形态学鉴定，选取形态特征明显的性成熟天锡杜拉蚓作为研究群体。试验蚯蚓在采集当日用70%酒精处死，保存于95%酒精中，备用。

1.3 试验方法

以蚯蚓尾部体壁组织为材料，利用试剂盒DNeasy Tissue&Blood kit（QIAGEN）提取DNA。

PCR扩增与DNA测序。16S引物序列：上游CTT AAA GAT TTT GGC GGT GTC，下游CTC TTG CAC GGT TAG GAT AC；ND1引物序列：上游GAA TAG TGC CAC AGG TTT AAA C，下游TTA ACG TCA TCA GAG TTA TC。PCR反应体系组分与反应条件见张玉峰[6]。采用1%琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物质量。测序工作由北京金唯智公司完成，DNA测序引物与PCR上游引物相同。对测序峰图杂乱的DNA样品，进行重复扩增与测序。

通过DNASTAR v.7.1.0软件中的SeqMan应用程序，对DNA序列进行观察、对齐、删除空隙和两端杂乱序列信号并转换.ab1格式结果为FASTA格式。将测序结果经BLAST在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，与其相匹配的序列是蚯蚓16S rRNA、ND1等基因序列，并且匹配度均＞90%，说明扩增和测序结果准确可靠。利用分子遗传软件MEGA 5.0[10]计算各地理群体之间的遗传距离（Kimura 2-Pairwise distance），分析各组DNA序列的碱基频率、保守位点和变异位点。利用DNaSP 5.0软件[11]，分析单倍型多样性指数（h）、单倍型数量（H）与分布、核苷酸多样性指数（Pi）。

利用SPSS统计软件，对天锡杜拉蚓的遗传多样性与土壤环境要素进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 DNA序列组成与多态性

16S、ND1全部DNA序列的平均单倍型多样性分别为0.76和0.64，平均核苷酸多样性分别为0.042和0.039。从各地理种群的单倍型多样性和核苷酸多样性信息（表2）可以看出，不同地理群体中，16S片段、ND1片段的单倍型多样性范围分别为0.12～0.90和0.15～1.00，核苷酸多样性范围分别为0～0.050和0～0.380。对DNA序列进行编辑、剪接，结果显示，16S rRNA有效片段长度为524 bp，ND1序列有效长度为685 bp。ND1序列中有392个变异位点，其中，简约信息位点186个，单核苷酸多态位点206个；16S序列中有363个变异位点，其中，简约信息位点247个，单核苷酸多态位点116个。廊坊群体的DNA隔离位点与碱基颠换数较高，而承德群体的碱基转换数较高。DNA序列变异位点比例分别为14.8%（ND1）、13.0%（16S）。16S和ND1序列中腺嘌呤和胸腺嘧啶含量丰富（64.6%，65.4%）。群体间平均遗传距离（表3）分别为0.045（16S）、0.054（ND1）。

表2 蚯蚓测序样本的遗传多样性Table2 Genetic diversity of earthworm sequencing samples

表3 地理群体间K2-P遗传距离Table3 Kimura 2-Pairwise Genetic distances between geographic groups

2.2 蚯蚓遗传多样性与土壤养分含量的相关性

ND1序列的单倍型数量与土壤有机碳含量呈极显著正相关（r=2.167，P＜0.01）、与全氮含量呈显著正相关（r=8.648，P＜0.05），独享单倍型数量和单倍型多样性均与土壤速效磷含量呈显著负相关（r分别为-0.070 6和-0.013 3，P均＜0.05）；其他遗传多样性

指标与土壤养分含量的相关性均不显著。

3 结论与讨论

Edwards[1]指出陆栖蚯蚓的分布与土壤性质具有密切关系，其与同事们首次提出了环境因子可能对陆栖蚯蚓的遗传多样性产生影响，蚯蚓种群遗传变异与土壤因子之间具有一定的相关性，因此，可能起因于祖先种在土壤环境中的迁移、定居所形成的现有种群格局是在环境因子的作用下所形成的遗传格局，而不是形态学格局。Novo等[12]研究表明，基于COI序列的西班牙陆栖蚯蚓（Hormogaster elisae）遗传距离与土壤类型具有显著的相关性，而遗传距离、土壤理化性质与蚯蚓体长之间的相关性均不明显。本研究结果显示，D.gisti种群内遗传距离与土壤因子之间的相关性不显著，而地理群体的单倍型数量、核苷酸多样性与土壤理化性质（有机碳、全氮、速效磷含量）之间具有显著的相关性。虽然这些研究类群和研究结果略有不同，但在土壤性质影响蚯蚓种群遗传多样性的研究结论上均较为一致。然而，背暗流蚓（Aporrectodea caliginosa）单倍型的分布状况与土壤因子之间并没有显著的相关性[13]。正蚓科蚯蚓，如背暗流蚓为表栖型（epigeic）蚯蚓，可能是由于长期生活在土壤表面的潮湿枯枝落叶层下，并未深入到土壤中生活，所以土壤性质的改变对其遗传变异的影响较小；而天锡杜拉蚓隶属链胃蚓科，为浅居型或上食下居型（epiendogeic）。因此，蚯蚓种类的分类学差异、生态习性以及对土壤偏爱程度的差异可能是上述结论存在差异的主要原因。Novo等[12]利用地理距离隔离模型（IBD）解释了西班牙陆栖蚯蚓高度的遗传变异，地理种群之间距离越远，其遗传变异程度越高。此外，不同的分类地位、生活习性差异、基因片段长度也是遗传差异的重要因素。

本研究运用线粒体部分基因片段对河北地区蚯蚓种群多样性进行分析，并探究了多样性的影响因素，结果表明：（1）基于线粒体16S基因的天锡杜拉蚓种群遗传变异水平略低于ND1基因；（2）遗传多样性与部分土壤理化指标具有显著的相关性。这为我国蚯蚓分子生态学的发展提供了重要的基础资料。

但是，本次研究仍有如下问题有待后续深入探索。（1）各采集地点蚯蚓样本数量差异是对种群遗传多样性，尤其是单倍型分布以及多样性分析的一个重要影响因素。因此，进一步拓展蚯蚓的采集地点，是未来研究中值得重视的问题。（2）利用16S、ND1序列等引物可以对天锡杜拉蚓扩增出有效片段，而COI通用引物以及重新设计的引物均不能有效地扩增出相应的PCR产物，因此，优化已知基因PCR反应所需的扩增引物，也是未来需要解决的一个热点问题。

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Analysis of Genetic Diversity of Drawida gisti and Soil Properties

ZHANG Yu-feng1，LIU Ying-ying1，LI Cong-sheng1，BI Yan-meng2，SHEN Lei1
（1.College of life Sciences，Langfang Teachers University，Langfang 065000，China；2.College of Resources and Environmental Sciences，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

The study aimed to discussing relation between earthworm genetic diversity and soil environment.Based on field studies conducted from July to October 2015，it was analyzed the genetic diversity of Drawida gisti using mitochondrial 16S and ND1 genes which were amplified by PCR in samples obtained from twenty-three localities，DNA polymorphism within and between groups was analyzed.The average haplotye diversity based on 16S and ND1 genes were 0.76 and 0.64，respectively，mean nucleotide diversity were 0.042 and 0.039，respectively，mean genetic distance between groups were 0.045 and 0.054，respectively.Genetic variation was significantly influenced by soil properties.

Earthworm；Drawida gisti；Genetic diversity；Soil properties；Hebei District

Q958

A

1008-1631（2016）04-0045-04

2016-01-06

河北省自然科学基金项目（C2015408038）；河北省大学生创新创业训练项目(201510100034)；河北省高等学校科学技术研究项目（QN2014055）；廊坊师范学院博士自然科学基金项目（LSBS201305）

张玉峰（1982-），男，河北沧州人，讲师，博士，主要从事土壤动物生态学工作。E-mail：805758301@qq.com。