孙科明，孙华文，曾放，刘顺，杨厚涞，吴红学

(武汉大学人民医院，武汉430060)



·基础研究·

IL-33对克罗恩病小鼠肠组织细胞因子及转录因子的影响

孙科明，孙华文，曾放，刘顺，杨厚涞，吴红学

(武汉大学人民医院，武汉430060)

目的 探讨IL-33对克罗恩病(CD)小鼠肠组织细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β)及转录因子(T-bet、GATA-3、FOXP3)的影响。方法 选择雌性BALB/c小鼠45只，随机分为对照组、TNBS组、IL-33组，每组15只。TNBS组、IL-33组给予TNBS/50%乙醇混合溶液灌肠建立CD模型，对照组仅予生理盐水灌肠。灌肠后TNBS组腹腔注射PBS，IL-33组腹腔注射重组鼠IL-33(rIL-33)，对照组腹腔注射PBS。各组于腹腔注射第5天处死，取肠组织行HE染色，观察肠组织病理变化；采用ELISA法检测肠组织上清液IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β,Western blotting法检测肠组织T-bet、GATA-3、FOXP3蛋白表达。结果 与对照组比较，TNBS组肠组织炎症明显；肠组织IFN-γ水平升高，IL-4、IL-10、TGF-β水平降低(P均<0.05)；T-bet蛋白表达升高，GATA-3、FOXP3蛋白表达降低(P均<0.05)。与TNBS组比较，IL-33组肠组织炎症相对较轻；IFN-γ水平降低，IL-4、IL-10、TGF-β表达升高(P均<0.05)，T-bet蛋白表达降低，GATA-3、FOXP3蛋白表达升高(P均<0.05)。结论 IL-33能缓解CD小鼠病情，其机制与抑制Th1细胞分化、诱导Th2和Treg细胞产生有关。

克罗恩病；白细胞介素33；细胞因子；转录因子

克罗恩病(CD)是炎症性肠病(IBD)的一种，其发病机制至今尚不完全清楚，免疫功能紊乱和Th1细胞异常活化可能是导致CD的重要因素[1～3]。Th1细胞主要通过分泌IFN-γ等细胞因子发挥致炎作用，而Th2细胞分泌的IL-4及Treg细胞分泌的IL-10、TGF-β等细胞因子可抑制Th0向Th1细胞分化，起到缓解炎症的作用。IL-33是最新发现的IL-1家族成员，其受体是ST2，二者结合后通过信号转导途径引起机体免疫应答的改变，还可诱导IL-4、IL-10、TGF-β等细胞因子的分泌[4]，继而影响Th1、Th2、Treg等细胞，起到免疫调节作用。研究发现，IL-33在不同疾病中发挥的作用不尽相同，如加重哮喘、关节炎等病情[5，6]，缓解动脉粥样硬化、肝炎等病情[7，8]。2015年5～10月，我们观察了重组鼠IL-33(rIL-33)对CD小鼠免疫相关细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β)及转录因子(T-bet、GATA-3、FOXP3)表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雌性BALB/c小鼠45只，SPF级，6～8周龄，体质量14～20 g，由武汉大学动物实验中心提供，动物许可证号：w20150467。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，美国Sigma公司；4%中性甲醛溶液，武汉谷歌生物科技有限公司；TRIzol，美国Invitrogen公司；rIL-33，美国RD公司；IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β ELISA试剂盒，美国R&D公司；GAPDH抗体，杭州贤至生物科技有限公司；FOXP3、GATA-3抗体，武汉三鹰生物技术有限公司；T-bet抗体，美国Santa公司；HRP标记的羊抗小鼠二抗，武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物模型制备及处理 所有小鼠适应性饲养7天，随机分为对照组、TNBS组、IL-33组，每组15只。TNBS组、IL-33组参照Kim等[9]的方法建立CD模型[按TNBS水溶液∶50%乙醇(1∶1)混合，取100 μL肛门灌注一次]，造模前禁食24 h、不禁水。对照组肛门灌注100 μL生理盐水。液体缓慢灌注完毕，拔出导管，保持小鼠倒立姿势60 s，灌肠后正常饲养。灌肠后对照组腹腔注射PBS 100 μL/次，1次/d；TNBS组腹腔注射PBS 100 μL/次，1次/d；IL-33组腹腔注射含2 μg rIL-33[10]的PBS 100 μL/次，1次/d。各组均连续注射4天。第5天颈椎脱臼法处死，取肛门至回盲部肠管。

1.3 相关指标观察

1.3.1 肠组织病理形态观察 取各组肠组织，4%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚切片。切片经60 ℃烤箱烤片后，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱苯，蒸馏水冲洗；苏木精染色，自来水冲洗；1%盐酸镜检分化，自来水冲洗至切片颜色变蓝；梯度乙醇脱水，0.5%伊红乙醇溶液对比染色，二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜下观察各组肠组织病理形态变化。

1.3.2 肠组织上清液IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β检测 取10 mg肠组织加入1 mL PBS混合液(pH=6.0，内含1 μg抑肽酶、亮肽素、胃蛋白酶抑素A)，剪碎匀浆，4 ℃ 12 000 g/min离心20 min，取上清液，保存备检。采用ELISA法检测IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β。

1.3.3 肠组织T-bet、GATA-3、FOXP3蛋白表达检测 采用Western blotting法。剩余肠组织用RIPA裂解液提取蛋白，测定蛋白的浓度和纯度后，取50 μg总蛋白上样电泳，根据蛋白分子量配置10% PAGE凝胶电泳，直至溴酚蓝前沿跑出胶后停止电泳；转膜(湿转法)，取出凝胶根据Marker切取目的条带，用蒸馏水冲洗，剪取与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜和滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中，按照黑色板→纤维垫→滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸→纤维垫→白色板依次放好，夹紧板后放入转膜仪内，黑色板的一面对黑色负极。转膜条件：200 mA，120 min；封闭：用含5%脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h；一抗：用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜，抗体T-bet 1∶100稀释、GATA-3 1∶500稀释、FOXP3 1∶1 000稀释；二抗：TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，5 min/次，用封闭液稀释HRP标记的羊抗小鼠二抗(1∶50 000稀释)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2 h；显色曝光：TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，5 min/次。每张膜滴加适量的ECL化学发光底物，孵育数分钟，待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的化学发光底物，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影。采用Gel-Pro Analyzer分析处理条带，计算灰度值。

2 结果

2.1 各组肠组织病理改变 对照组肠黏膜完整，腺体排列规则，无炎性细胞浸润；TNBS组肠固有层明显受损，部分区域腺体消失，大量炎细胞浸润；IL-33组肠黏膜相对完整，腺体排列较为有序，少量炎细胞浸润，小面积溃疡。见插页Ⅱ图5。

2.2 各组肠组织上清液IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平比较 见表1。

表1 各组肠组织上清液IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与TNBS组比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 各组肠组织T-bet、GATA-3、FOXP3蛋白表达比较 见表2。

表2 各组肠组织T-bet、GATA-3、Foxp3蛋白相对表达量比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与TNBS组比较，#P<0.05。

3 讨论

CD是一种可发生于胃肠道任何部位的慢性、反复发作的非特异性全肠壁炎，至今尚无特异性的治疗手段。目前普遍认为，免疫功能异常是CD发病的主要原因之一，尤其是Th1细胞的过度活化被认为是CD的主要发病机制。

IL-33是IL-1家族中的一种新型细胞因子，其基因定位于人类9号染色体上，编码含270个氨基酸的IL-33前体蛋白，分子质量约30 kDa，主要表达于内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞等[11]。IL-33的受体是ST2[12]，二者结合后，对免疫系统进行调控，如IL-33可诱导IL-4、IL-10、TGF-β等细胞因子的分泌。有研究发现，IL-33可能是一种共刺激因子，既能促Th1型适应性免疫应答也能促Th2型适应性免疫应答[13]。目前对IL-33在IBD发病过程中的作用研究结论不一。有研究认为，IL-33可能在IBD发病过程中具有双重作用[14,15]；也有研究认为，IL-33对IBD患者可能具有保护作用[16]。Seidelin等[17]研究发现，溃疡性结肠炎患者肠黏膜组织IL-33 mRNA水平明显高于正常肠黏膜组织，且其表达与溃疡性结肠炎疾病活动度、活动指数、内镜下评分明显相关。Kobori等[18]研究发现，活动性溃疡性结肠炎患者肠黏膜IL-33 mRNA表达特异性升高，而非活动性溃疡性结肠炎患者和CD患者并未升高。由于该研究对CD患者样本的采集量较少，其结果的可信度不大。Duan等[10]研究发现，IL-33在通过化学方法诱导出的IBD中具有保护作用。以上研究说明，IL-33与IBD的发病有关。

本研究首先建立了小鼠CD模型，然后用rIL-33、PBS进行干预，处死小鼠，取肠组织行HE染色，发现TNBS组肠组织炎症明显，说明CD模型制备成功。而IL-33组肠组织炎症明显较TNBS组轻，说明IL-33能缓解CD的发病进程。本研究还发现，IL-33组肠组织上清液IFN-γ水平较TNBS组明显降低，IL-4、IL-10和TGF-β水平明显高于TNBS组。说明IL-33可抑制Th1分化，促进Th2和Treg的分化。大量研究证实，Th1细胞的特异性转录因子T-bet、Th2细胞的特异性转录因子GATA-3、Treg细胞的特异性转录因子FOXP3对其相应细胞的生长和功能具有重要作用[19～22]。本研究发现，IL-33组T-bet蛋白相对表达量明显低于TNBS组，而GATA-3、FOXP3蛋白相对表达量明显高于TNBS组。进一步证实了上述结论。

综上所述，IL-33能缓解CD小鼠病情，其机制可能与抑制Th1细胞分化、诱导Th2和Treg细胞的产生有关。

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国家自然科学基金资助项目(81170368)。

孙华文(E-mail： sunhuawen888@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.008

R574.4

A

1002-266X(2016)40-0029-03

2015-11-10)