◎王小国

（三门峡职业技术学院 食品园林学院，河南 三门峡 472000）

技术与应用

芍药ITS片段重组质粒的构建及筛选

◎王小国

（三门峡职业技术学院 食品园林学院，河南 三门峡 472000）

目的：重组质粒构建、转化和α-互补筛选是基因工程的中心环节，为了对纯化回收后的芍药ITS片段进行重组质粒构建和筛选。方法：通过芍药纯化回收后的ITS片段，进行了重组质粒构建、连接和α-互补筛选，结果ITS片段和PMD18-T Vector比例为0.5∶1时较为适中，转化效率较高，培养时间以12h为宜，当培养时间过长时，易长出卫星菌落。结论：构建了芍药ITS片段重组质粒，为下一步利用ITS序列对芍药进行系统发育分析奠定基础。

芍药；ITS；重组质粒；构建；筛选

重组质粒构建、转化和α-互补筛选是基因工程的中心环节，在功能基因的分离、克隆和表达中有着广泛地应用[1-3]。其基本原理是在体外将目的基因通过DNA连接酶连接到质粒载体上，转化到氯化钙处理后的大肠杆菌E.coli感受态细胞（competent cell）中，并利用质粒载体上含有的β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列，使重组体在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，β-半乳糖苷酶将底物半乳糖苷（X-Gal）水解，形成蓝色菌落，而有外源DNA片段重组质粒的细菌则形成白色菌落的过程。

芍药（Paeonia lactiflora）为芍药科芍药属多年生草本植物，有较高的观赏和药用价值[4,5]，但品种变异丰富，表型性状多样[6]，给芍药的准确分类和亲缘关系的鉴定带来一定困难，ITS(Internal transcribed spacer)是位于核基因组中的一段内转录间隔区[7]，即使在相近的种群中也有着高度的变异，因此常用于植物的系统发育分析，在辨明同属物种的关系中扮演重要的作用[8]。

目前，已有很多对植物ITS片段序列分析的报道。例如：李喜凤对不同种群蒲公英内转录间隔区(ITS)序列及其亲缘关系进行了分析[9]，刘建全等[10]利用ITS探讨了青藏高原特有植物华福花属的亲缘关系，序列比较和分支分析表明，华福花属与五福花属近缘，为华福花属植物的亲缘关系研究提供了参考资料。本研究通过纯化回收后的芍药ITS片段，进行重组质粒构建、连接和α-互补筛选，为下一步利用ITS序列对芍药进行系统发育分析奠定基础。

1 试验材料

试验材料：三门峡牡丹苑采集的芍药当年生嫩叶。

2 试剂及仪器

主要试剂有：PMD18-T Vector、T4连接酶和E.coli感受态，LB培养基，X-Gal、IPTG和Amp（均为市售）等。所需仪器主要有：超低温冰箱（美国Thermo公司），低温冰箱，恒温水浴锅，恒温摇床，高速离心机，超净工作台（吴江市净化设备总厂），微量移液器（Eppendorf）等。

3 试验方法

3.1 芍药DNA的提取

（1）称取芍药嫩叶100mg，加入液氮研磨，将粉末迅速转移至2ml离心管中,加入700μl预热的缓冲液GP1；（2）颠倒混匀，将离心管放置在预热65℃的恒温水浴锅中水浴30min，水浴过程中每隔5min混匀；（3）30min后加入700μl氯仿充分混匀，12000rpm离心10min；（4）小心将上层水相转移至新的EP管中，加入800μlGP2充分混匀；（5）将液体转移至吸附柱中，12000rpm离心2min，弃掉废液；（6）用移液枪吸取500μl缓冲液GD，加入到吸附柱中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱重新放回到收集管中；（7）用移液枪吸取600μl漂洗液PW，加入吸附柱中，12000rpm离心2min；（8）将废液倒掉，吸附柱重新放入收集管中，重复清洗步骤，倒掉废液；（8）离心5min；（9）将吸附柱置于室温下10分钟左右，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液；（10）将晾干后的吸附柱放入一个新EP管中，100μl ddH2O溶解后离心10min，将溶液收集到离心管中。

3.2 芍药ITS片段的扩增

PCR反应体系为 10μL，10×buffer1μL，dNTP0.8μL，Taq酶 0.05μL，Primer各 0.5μL，DNA模板0.3μL，ddH2O6.85μL。扩增程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1.5min，进行20个循环反应后，72℃延伸10min。

3.3 芍药ITS片段的回收

将扩增出的芍药ITS序列的PCR产物，进行琼脂糖凝胶回收，具体操作步骤如表1所示：

表1 芍药ITS片段的回收

3.4 芍药ITS片段的体外连接

在EP管中进行芍药ITS片段的体外连接，反应液总体积10μl，其组成如表2：反应液于16℃反应30分钟后，4℃连接过夜。

3.5 感受态细胞的制备

新鲜的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。首先，从37℃培养16-20h的平板上挑取单菌落，转移至含有100mlLB液体培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h（180r/min）。然后将细菌转移到无菌、预冷的离心管中，冰浴10min，5000r/min常温离心2min，弃上清。之后以10ml预冷的0.1mol/LCaCl2重悬沉淀，冰浴20min。5000r/min常温离心2min，弃上清。用预冷的0.1mol/LCaCl2重悬沉淀，分装后于-80℃超低温冰箱中保存备用。

3.6 热激转化

将感受态细胞取出后冰上融化，每管中加入10μl过夜连接反应液，冰上静置30min，42℃水浴60s（时间可根据EP管为尖底或圆底进行适当调整），迅速转移至冰水混合物中，冷却3min，每管中加入LB液体培养基，固定于振荡培养箱中，180r/min振荡培养1h后，5000 r/min常温离心2min，弃上清。

3.7 α-互补筛选

将菌液吹打混匀后用无菌玻璃珠均匀涂布于含有X-Gal、IPTG和Amp的LB平板中 （作一空白对照），37℃培养12h后挑选阳性克隆。

表2 连接反应液组成

图1 所提取

图2 扩增的

4 结果及分析

4.1 提取的DNA电泳结果

提取的芍药DNA电泳结果如图1所示。

从图1中可看出，所提取芍药DNA的电泳条带清晰，质量较高，无蛋白和RNA等杂质。

4.2 ITS扩增结果

芍药ITS扩增结果如图2所示。由图可知，扩增的ITS片段大小约800bp，无扩增杂带。

4.3 α-互补筛选结果

α-互补筛选结果如图3所示。

从图3可知，ITS片段和PMD18-T Vector比例为0.5:1时较为适中，转化效率较高，培养时间以过夜为宜。当培养时间过长时，则会长出卫星菌落（图4），从而影响到克隆的挑选。图5为不含重组质粒的E.coli在Amp培养基上生长的情况，由于PMD18-T Vector带有Amp抗性，而无重组质粒的对照E.coli在含Amp的培养基上没有菌落形成，表明Amp未失活，生长的E.coli菌落均带有抗性载体。

图3 α-互补筛选结果

图4 卫星菌落

图5 不含重组质粒的E.coli在Amp培养基上的情况

5 小结

本研究通过纯化回收后的芍药ITS片段，进行了重组质粒构建、连接和α-互补筛选，为下一步利用ITS序列对芍药进行系统发育分析奠定基础。但在具体操作过程中，应注意以下一些方面：1）倒平板时应控制好培养基温度，温度不要过高，否则会使加入的氨苄西林失效，并在平板培养基和培养皿盖表面形成大量冷凝水，冷凝水滴到培养基上后会造成污染及影响单菌落的形成；2）E.coli感受态细胞较脆弱，用移液枪轻轻吸打使其悬浮时动作要轻；3）-80℃冰箱储存的感受态细胞要尽快使用，一般在半年后，感受态转化率会降低；4）培养时间不能过长，以免卫星菌落的出现；5）含有X-gal的培养基4℃避光保存，在1-2周内使用等。此外，α-互补筛选除了利用质粒载体上含有的β-半乳糖苷酶基因的调控序列，使质粒大肠杆菌重组子产生β-半乳糖苷酶将底物X-Gal水解，通过颜色变化进行筛选之外，也同时利用了Amp的抗性筛选，单一的大肠杆菌感受态是不具有抗性的，只有转化了质粒载体的大肠杆菌才具有Amp抗性，所以在Amp+培养基上形成的菌落都是转化了质粒载体的大肠杆菌，不带有质粒载体的大肠杆菌或其他杂菌在Amp+培养基上是不会生长的。当然，形成的白色菌落也可能是空载体，判断其是否真正插入了目的片段，还需要经过进一步的菌液PCR或菌落PCR验证之后才能确定。

国内诸多研究者对T载体构建、α-互补筛选机制及改进方法进行了研究。钟星等[11]构建了定向T载体，重组效率100%，结果表明该载体非常适合基因的克隆和表达；齐向辉等[12]以常用的克隆载体pGEM．3zf(+)为出发材料，将其改造成通用的T载体；郑高阳等[13]将平板上生长的蓝色菌落进行回收后扩大培养，然后从大肠杆菌中提取质粒，重新构建了T载体，大大节约了成本，并对T载体构建及构建过程中常见问题的处理方法进行了探讨；周玉亭等[14]对α-互补机制进行了探究；潘韵芝[15]对蓝白斑筛选技术的改进并探讨了其在生物医学方面的新应用，可见载体构建和重组子高效筛选是当前很多研究者共同关注的问题。

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（责任编辑 卞建宁）

S682.12

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1671-9123（2016）03-0136-04

2016－06－27

王小国（1977-），男，山西长治人，三门峡职业技术学院食品园林学院讲师。