覃鸿妮， 张兰兰

(1.苏州工业园区服务外包职业学院,江苏苏州 215123；2.金唯智(苏州)生物科技有限公司，江苏苏州 215123)



载体浓度和感受态对大分子载体转化效率的影响

覃鸿妮1， 张兰兰2

(1.苏州工业园区服务外包职业学院,江苏苏州 215123；2.金唯智(苏州)生物科技有限公司，江苏苏州 215123)

[目的]研究载体量和感受态对阳性克隆率的影响。[方法]利用引物拼接PCR技术，自行设计26条引物合成一个835 bp的目的基因，将该基因与约20 kb的大分子载体连接构成重组质粒。在1 500 ng目的基因底物量的基础上，设置50、100、150、200、250、300 ng 6个梯度载体量，得到的重组反应产物再转化入Top10F′、DH5α、Stbl3、Epi400、JM108、SCSI 6种不同的感受态中， 组成36个试验组合。[结果] 不同载体量阳性克隆率由大到小依次为200、250、300、150、100、50 ng，200 ng的阳性克隆率最高可达75%，平均达28.5%。不同感受态细胞阳性克隆率由大到小依次为Stbl3、Top10F′、DH5α、JM108、Epi400、SCSI，Stbl3在任何载体浓度下均高于其他感受态，平均阳性克隆率为42.4%。[结论]载体量和感受态均明显影响阳性克隆率，最佳组合为200 ng的载体分子量配合Stbl3感受态，阳性克隆率可达75%。

大分子载体；载体浓度；感受态； 转化效率

质粒载体是细胞中具有自主复制能力的较小DNA分子，是基因工程中重组DNA 最常见的运载体，可以将目的DNA片段通过重组DNA技术，导入受体细胞中进行繁殖和表达[1-7]。质粒载体的DNA长度从数千碱基对到数十万碱基对不等，相对于分子量较小的载体，大分子载体在细胞外的重组连接效率低，在感受态中转化效率低，在宿主细胞内的拷贝率低，传代易产生目的DNA的随机突变和缺失，表达很不稳定[8-10]。因此需要有一个优化的重组连接体系和一个优化的感受态转化体系，提高大分子载体的重组效率和转化效率[11-13]。笔者利用引物拼接PCR(Polymerase Chain Reaction)技术，自行设计26条引物合成一个835 bp的目的基因，将该基因与约20 kb的大分子载体pCMV5连接构成重组质粒。在1 500 ng目的基因底物量的基础上，以50、100、150、200、250、300 ng进行6个梯度载体量的重组反应，得到的重组反应产物再转化入Top10F′、DH5α、Stbl3、Epi400、JM108、SCSI 6种不同感受态中，交叉组成36种不同的组合，分别对这36种组合所得到的阳性克隆率进行分析，以期得到针对大分子载体进行重组克隆的最优载体量和最佳感受态。

1　材料与方法

1.1试验材料1.1.1目的基因。选定一个长835 bp的目的基因(图1)，整体GC含量为56.17%，非高GC含量基因，且GC含量波动较小，总体较易扩增(图2)。目的基因无明显正向重复，无明显反向重复，无明显自身重复，引物设计无难度，PCR扩增较易。1.1.2目标载体。目标载体为经人工改造的pCMV5载体，人工加入AMP抗性，载体总长19 043 bp，属于大分子质粒载体(图3)。1.2试验方法

1.2.1目的基因的合成。根据基因序列委托相关公司设计和合成PCR扩增所需的26条引物(表1)，将引物稀释到20 pmol/μL，每条引物取2 μL混匀作为引物混液，通过2轮PCR合成目的基因。1.2.2不同载体量设置。取36个分别装有10 μL重组酶的PCR管，分成A、B、C、D、E、F 6组，每组6个，分别编号A1～A6，B1～B6，C1～C6，D1～D6，E1～E6，F1～F6，并按表2(以A组为例)加入不同的载体量。PCR仪50 ℃反应1 h，-20 ℃保存。

1.2.3不同感受态设置。Top10F′感受态包括A1～A6，DH5α感受态包括B1～B5，Stb13感受态包括C1～C6，Epi400感受态包括D1～D6，JM108感受态包括E1～E6，SCSI感受态包括F1～F6。

1.2.4菌检结果判定。36个平板，每个平板挑选24个斑进行电泳检测，由于电泳样品太多，在结果中不直接显示电泳图，而是统计出每24个克隆中阳性克隆的个数除以24，得到阳性克隆率。菌检产物阳性克隆的判断方法：将电泳条带与Ladder比对，1 149 bp即阳性克隆记为1，412 bp即空载体记为0，引物二聚体即该菌液样品是杂斑生长记为0。

图1　目的基因全序列Fig. 1　Sequence of objective gene

图2　目的基因GC含量Fig. 2　GC ratio of objective gene

图3　目标载体结构Fig. 3　Analysis of vector structure

序号Code序列Sequence(5'-3')碱基数Basenumber1GGGGCTGCTGACCTGGCTCATGTCCATCGATGTCAAGTACCAGATCTGGAAG522GAACGAGTTGTCCGTGAAGATGACCCCGAACTTCCAGATCTGGTACTTGACATC543TCTTCACGGACAACTCGTTCCTGTACCTGGGCTGGTACATGGTGATGTCC504CGGCAAAGAAGAAGTTGTTGTAGTGGCCCAGGAGGGACATCACCATGTACCAGC545CAACAACTTCTTCTTTGCCGCCCACCTGCTGGACATCGCCATGGGGGTCAAGA536TTGTGGGTGACAGAGGAGAGGATGGTACGCAGCGTCTTGACCCCCATGGC507CTCTCCTCTGTCACCCACAATGGGAAACAGCTGGTGATGACTGTGGGCCTCCT538AAGGCCACCACAGTGTACAGGTAGACCACGACGGCCAGGAGGCCCACAGTCATC549CTGTACACTGTGGTGGCCTTCAACTTCTTCCGCAAGTTCTACAACAAGAGCGA5310GCACTTCATGTCCGGCTCGTCCTCGTCCTCGCTCTTGTTGTAGAACTTGC5011AGCCGGACATGAAGTGCGATGACATGATGACGTGCTACCTGTTCCACATGTACGT5512TCGTCCCCGATGCCTCCGCCAGCCCGGACGCCCACGTACATGTGGAACAGGTAGC5513GGCATCGGGGACGAGATCGAGGACCCAGCGGGCGATGAATACGAGCTCTAC5114AAGAAGAAGGTGATGTCGAAGACCACCCGGTAGAGCTCGTATTCATCGCC5015GTCTTCGACATCACCTTCTTCTTCTTCGTCATTGTCATCCTGCTGGCCATC5116GGAGCTCGCCGAAGGCGGCGATAATCAGACCCTGGATGATGGCCAGCAGGATGA5417CCTTCGGCGAGCTCCGAGACCAGCAGGAGCAAGTGAAGGAAGATATGGAG5018CTGCCAATCCCGCAGATGAAGCATTTGGTCTCCATATCTTCCTTCACTTGCT5219CTGCGGGATTGGCAGTGACTACTTCGATACCACGCCGCACGGCTTCGAGACCC5320CATGTAATTGGCCAGATTGTGCTCCTCTAGCGTGTGGGTCTCGAAGCCGTG5121CACAATCTGGCCAATTACATGTTCTTCTTGATGTATCTGATAAACAAGGAC5122ACTCCTGGCCCGTGTGCTCCGTCTCGTCCTTGTTTATCAGATACATCAAGAA5223CACACGGGCCAGGAGTCCTACGTCTGGAAGATGTATCAGGAGAGGTGCTGGG5224ACTGCTTGCGGAAGCAGTCGCCGGCGGGGAAGAAGTCCCAGCACCTCTCCTGATA5525CTGCTTCCGCAAGCAGTACGAGGACCAGCTGAGCTGAGAAGCTTGCATGCCTGCA5526GTCACAGGGATGCCACCCGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT55

表2　连接体系

2　结果与分析

2.1目的基因的合成由图4可知，目的基因的PCR产物在750～1 000 bp，与其理论值大小855 bp相符。

图4　PCR产物电泳图Fig. 4　Electrophoretogram of PCR products

2.2载体线性化由图5可知，酶切后理论大小为19 043和98 bp，由于5 000 Ladder最小值为100 bp，因此,98 bp在图中无法显示，酶切结果与理论值相符。

2.3转化后菌落生长情况在6种感受态中，A1～F6共36个平板，分别为加入载体量50、100、150、200、250、300 ng的菌落生长情况。由图6～10可知，36个平板菌落均生长良好。

注：1、2、3分别为5 000 bp Ladder、酶切样品、10 kb Ladder。Note:1,2,3 bands were 5 000 bp Ladder,enzyme digestion sample and 10 kb Ladder,respectively.图5　载体酶切电泳图Fig.5　Electrophoretogram of restriction enzyme digestion products

2.4菌检阳性克隆率由表4和图12可知，不同载体浓度对大分子载体的阳性克隆率有明显影响，平均阳性克隆率由大到小依次为200、250、300、150、100、50 ng，在所有感受态中，200 ng的阳性克隆率均最大，最高可达75%，平均达28.5%。载体浓度低于100 ng转化效率不到10%。

不同感受态对大分子载体的阳性克隆率有明显影响，平均阳性克隆率由大到小依次为Stbl3、Top10F′、DH5α、JM108、Epi400、SCSI，最好的感受态是Stbl3，在任何载体浓度下均高于其他感受态，平均阳性克隆率为42.4%。JM108、Epi400、SCSI 3种感受态的平均阳性克隆率均低于10%。

图6　Top10F′ 感受态菌落生长情况Fig. 6　The growth of colonies cultured in Top10F′

图7　DH5α感受态菌落生长情况Fig. 7　The growth of colonies cultured in DH5α

图8　Stbl3 感受态菌落生长情况Fig. 8　The growth of colonies cultured in Stbl3

图9　Epi400 感受态菌落生长情况Fig. 9　The growth of colonies cultured in Epi400

图10　JM108 感受态菌落生长情况Fig. 10　The growth of colonies cultured in JM108

图11　Scsi感受态菌落生长情况Fig. 11　The growth of colonies cultured in Scsi

%

3　讨论

对于一般的重组试验，载体加样量远低于200 ng，以最为普通的puc57系列载体为例，重组反应的载体加样量仅30 ng左右[1，3-4]。这就导致实验室在遇到较大的载体时，阳性克隆率低甚至为0的现象。不同感受态由于基因型的不同，对不同大小、不同类型质粒的拷贝率相差较大[14-18]。该研究选用的载体接近20 kb，较常用的3～4 kb的载体更有克隆难度。大分子载体由于具有重组效率低、转化效率低、拷贝率低、表达不稳定、不易提取、分离纯化困难等特点[8-10]，国内很多DNA服务公司都不愿意接受大分子载体的克隆，即使有相应的服务，由于失败率高，试验成本高，服务相应的价格也很高。该研究以约20kb的载体为例，选取6个梯度的载体量和6种不同的感受态进行试验，结果表明，载体量和感受态对阳性克隆率均有很大影响，并得到了最优组合，为提高大分子载体的克隆效率提供参考和借鉴。

4　结论

该研究针对约20 kb的大分子载体，在1 500 ng目的基因底物量的基础上，设置50、100、150、200、250、300 ng 6个梯度载体量，得到的重组反应产物再转化入Top10F′、DH5α、Stbl3、Epi400、JM108、SCSI 6种不同感受态中， 组成36个试验组合。结果表明，载体量和感受态均明显影响阳性克隆率。

当反应体系中的载体量过低时，重组反应无法得到足够多的阳性克隆，筛选效率很低。当反应体系的载体量过高时，挑斑筛选时又会筛选到较多的空载体，影响阳性克隆率。针对20 kb左右的载体，载体的分子量在200 ng左右阳性克隆率最高。相对于其他感受态，Stbl3对于大载体的拷贝能力远高于其他感受态。最佳组合为200 ng的载体分子量配合Stbl3感受态，阳性克隆率可达75.0%。

[1] 钟星，翟超，陈亮，等.构建定向T载体用于基因克隆和表达[J].生物工程学报，2013,29(4)：510-519.

[2] 于洋，蒋世翠，王康宇，等.大片段DNA克隆载体的研究进展[J].黑龙江农业科学，2015(2)：147-151.

[3] 吴亚锋，梁东春，郭刚，等.pUC-T载体的构建[J].天津医药，2005，33(3)：159-160.

[4] 李江，张俊芳，甄园丽，等.pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒的构建与蛋白表达[J].吉林大学学报(医学版)，2009,35(3)：415-418.

[5] 严飞，赵新宇，邓洪新，等.一种新的双元表达质粒pCMV-Myc-IRES-EGFP的构建及其表达[J].生物工程学报，2007,23(3)：423-428.

[6] 王洪振，周晓馥，宋朝霞，等.简并PCR技术及其在基因克隆中的应用[J].遗传，2003,25(2)：201-204.

[7] 郑宝强，王雁，彭镇华，等.卡特兰ACO基因克隆与反义表达载体的构建[J].核农学报，2009,23(3)：442-446.

[8]王弘，吴梧桐，顾学裘.脂质体作为生物大分子载体的研究进展[J].药物生物技术，2002,9(3)：171-174.

[9] 谭德勇，邓双胜，孟玲，等.改善大分子质粒DNA重组效率的新方法[J].生物化学与生物物理进展，1997,24(3)：281-283.

[10] 樊颖伦，赵开军.大片段克隆载体研究进展[J].中国生物工程杂志，2004,24(3)：12-16.

[11] LIU L,LIU Y G,XU X P,et al.Efficient linking and transfer of multiple genes bu a multigene assembly and transformation vector system[J].PNAS,2003,100(10):5962-5967.

[12] SHIZUYA H,KOUROS-MEHR H.The development and applications of the bacterial artificiakl chromosome cloning system[J].Keio journal of

medicine,2001,50(1):26-30.

[13] 张飞飞，石牡丹，尚广东.基于重组工程法高效转化效率的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株构建[J].安徽农业科学，2015,43(20)：29-31,72.

[14] 张岚岚，徐春燕，徐昌杰.大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素[J].中国细胞生物学学报，2004,26(4)：429-432.

[15] 杨坤，巩振辉，李大伟.大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体系的建立[J].北方园艺，2010(14)：127-130.

[16] 代军.大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化[J].江苏农业科学，2015,43(4)：53-54.

[17] 杨坤.E.coli高效感受态细胞转化体系的建立及诱导型瞬时表达载体的构建[D].杨凌：西北农林科技大学，2010:1-48.

[18] 涂知明，陈明洁，何光源，等.三种大肠杆菌高效感受态的制备及转化[J].华中科技大学学报(自然科学版)，2006,34(4):112-115.

Effects of Vector Density and Competent Cells on the Large Vector Transformation Efficiency

QIN Hong-ni1, ZHANG Lan-lan2

(1.Suzhou Industrial Park Institute of Services Outsourcing, Suzhou, Jiangsu 215123; 2.Genewiz (Suzhou) Biotechnology Co.,Ltd.,Suzhou, Jiangsu 215123)

[Objective] To research the effects of vector quantity and competence on the positive cloning rate. [Method] With a known gene sequence but in the absence of DNA template, we artificially designed 26 primers to synthesize a target gene of 835 bpinvitrousing overlapping PCR technique. The whole experiment design with two factors and six levels (36 combinations) was applied to study the effects of the vector density and competent cells on the large vector transformation efficiency. Based on the 1 500 ng target gene, the vector density grades were designed (50, 100, 150, 200, 250,300 ng), and then the recombinant plasmids were transformed into Top10F’, DH5α, Stbl3, Epi400, JM108, SCSI. [Result] The positive cloning rates of different vector amounts from big to small were in the order of 200, 250, 300, 150, 100 and 50 ng. The maximum positive cloning rate of 200 ng reached 75%; and the average value was 28.5%. The positive cloning rates of different competent cells from big to small were in the order of stbl3, Top10F′, DH5α, JM108, Epi400 and SCSI. Stbl3 was higher than other competent cells under any vector density. And its average positive cloning rate was 42.4%.[Conclusion] Both the vector density and competent cells have significant effects on the large vector transformation efficiency. The optimal combination is C4 with 200 ng vector density and Stbl3, the positive cloning rate of which could reach 75%.

MacromoIecular vector; Vector density; Competent cells; Transformation efficiency

A

0517-6611(2016)17-181-06

苏州工业园区服务外包职业学院教研教改研究课题(JG-201601)。

覃鸿妮(1983- )，女，湖北长阳人，讲师，博士，从事分子生物学研究。

2016-05-06

Q 81