●尹军力 陈 蓉 徐 飞(江苏省南京市红山森林动物园 江苏 南京 210028)

一例亚历山大鹦鹉沙门氏菌快速诊断

●尹军力 陈 蓉 徐 飞(江苏省南京市红山森林动物园 江苏 南京 210028)

沙门氏菌病是由沙门氏菌引起的以败血症、肠炎为主的疾病。由于可以感染人、多种家畜及野生动物，在公共卫生学上具有重要的研究地位。2015年5月，一只刚引进的亚历山大鹦鹉突然血便死亡，笔者通过沙门氏菌PCR快速鉴定为沙门氏菌感染。

1 发病情况

2015年5月，一群引进不久的亚历山大鹦鹉中，有一只突然死亡，仅肛门处有大量血便。解剖观察，肝脏质地脆、有片状黄色坏死灶；胰腺轻微出血；肾脏较脆；十二指肠后段及盲肠出血严重；其余脏器正常。寄生虫检查排除球虫。

2 细菌分离

无菌采集病死鹦鹉的肝、脾等组织接种于血平皿，37℃培养18～24小时后观察。从肝脏中分离出溶血小菌落，接种至麦康凯(MAC)平皿上长出无色透明菌落，接种至亚硫酸铋(BS)平板上长出带金属光泽的黑色菌落。经革兰氏染色，该菌为阴性杆菌，初步判定为沙门氏菌。

3 PCR鉴定

3.1细菌DNA提取

沙门氏菌标准株由安徽农业大学动物传染病实验室提供。细菌DNA提取采用热裂解法，即将各取150μL检测菌液、沙门氏菌标准株菌液和水(阴性对照)分别注入3根离心管中，100℃煮沸10分钟后，12 000r/分钟离心10分钟，取上清液为DNA模板。

3.2 PCR反应

检测沙门菌的特异性PCR引物为P1：5′-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG-3′，P2：5′-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA-3′，2×TapMIX均有上海生工生物有限公司合成提供。

反应总体积为25μL：2×TapMIX 12.5μL；引物P1、P2(5μmol/L)各1.25μL；双蒸水5μL；DNA模板溶液5μL。PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，经过32个循环；72℃延伸5分钟。

3.3电泳分析

取5μL PCR产物直接经1%琼脂凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)电泳，在凝胶成像仪中观察结果并拍照。检测菌样出现沙门菌特异性条带为495bp，见图1，表明该菌为沙门氏菌。

1.DNAMarkerDL2000；2.阴性对照；3.阳性对照；4.检测菌落图1 PCR扩增电泳图

4 药敏试验

以K-B法进行药物繁感试验。该菌米字接种于血平板，贴上药敏纸片(购自杭州微生物有限公司)，37℃培养24小时，观察结果。本菌对庆大霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考及诺氟沙星敏感。对先锋霉素、青霉素G钠、头孢曲松、氟哌酸、痢特灵、阿莫西林等耐药。

5 讨论

国内有报道沙门氏菌感染白鹭、鸵鸟、黑鹳、孔雀、鹦鹉等珍禽，并引起较大经济损失。本次鹦鹉死亡迅速，临床仅为血便，而从肝脏分离出沙门氏菌，说明该菌已造成全身败血症、严重的肠炎，符合该病临床特征。

在传统的沙门氏菌方法中，常规鉴别培养基分离和生化鉴定程序复杂、时间较长；全自动细菌鉴定仪鉴定成本较高、操作复杂；沙门菌A～F多价O抗原检测会因该菌发生S-T-R(光滑型-过渡型-粗糙型)变异丧失了正常的O抗原而不能被血清凝集或出现自凝现象造成假阴性。本文采用PCR方法对沙门菌组氨酸转运操纵子基因序列进行扩增，具有特异、快速(1～2小时)、简便、灵敏(DNA含量为14pg)等优点。因为检测细菌的核酸，所以该方法准确性较高。虽然该方法在家畜、家禽等临床上已运用较广，但这是首次运用在鹦鹉沙门氏菌病的检测中。

目前，沙门氏菌的耐药性引起了极大地关注。其产生耐药性的机制较多，如产生灭活酶和钝化酶、改变药物作用靶位点、通过生物膜产生耐药、外排泵产生耐药、甲基错配修复系统突变、可移动基因元件介导耐药及耐药基因的散播等，因此，药敏实验对该病的治疗具有指导作用，避免盲目用药、产生耐药性。本菌的耐药谱相对较窄，给用药提供了较多的选择性。

沙门氏菌广泛存在于自然界中，尤其在污水、土壤、感染动物的排泄物中。南京的5月正值梅雨季节，加之这批鹦鹉刚引进不久，其免疫力有所下降，因此快速分离鉴定细菌，同时结合药敏试验结果，合理地预防性用药，及时进行笼舍消毒，避免全群鹦鹉爆发沙门氏菌病，以减少损失。