冯　博，　蓝　英，　孙晓红，　张炜佳，　潘迎捷，　赵　勇*

（1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306）

副溶血性弧菌16S rRNA基因序列变异规律分析

冯博1，2，3，蓝英1，2，3，孙晓红1，2，3，张炜佳1，2，3，潘迎捷1，2，3，赵勇*1，2，3

（1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海 201306）

通过对副溶血性弧菌16S rRNA基因序列进行深度分析，研究其序列变异特点，为开发新的分型溯源靶点奠定基础。对111株分离自生鲜水产品的副溶血性弧菌16S rRNA基因测序，与GenBank中已有的副溶血性弧菌16S rRNA基因标准序列比对分析，对变异度比较大的序列建立了系统发育树，深入分析了基因的变异规律，并使用ERIC-PCR方法加以验证。不同副溶血性弧菌菌株16S rRNA基因变异主要集中在可变区V1和V2区，50～270 bp的区域内有38个碱基的相似度小于30%，103个碱基的相似度在30%～100%。另外，在V3区和V8区也各有1个碱基有比较明显的差异。副溶血性弧菌16S rRNA基因序列具有一定的变异性，该结果为副溶血性弧菌菌株分型溯源分析提供新的靶点奠定研究基础，同时为其微进化研究奠定理论基础。

副溶血性弧菌；16S rRNA基因序列；ERIC-PCR聚类分析；变异规律分析

副溶血性弧菌（Vibiro parahaemolyticus）是一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分布于各种淡水、海水、河口等水生环境，是水产品中最主要的食源性致病菌之一，极易引起肠道疾病［1-2］。自从1950年在日本首次发现V.parahaemolyticus以来，世界各地尤其是沿海地区都出现过不同程度的疾病爆发，造成了极大的安全隐患。准确地对V.parahaemolyticus进行分离鉴定，无论对于预防和治疗疾病、控制病菌传播还是研究病菌致病机理都具有重要的意义。

16S rRNA基因序列长约1.5 kb，具有高度的保守性和特异性，常被用于原核微生物系统发育学方面的研究［3］。近年来随着PCR及相关基因工程技术的发展，16S rRNA作为原核生物分类的重要分子标记，在细菌鉴定相关工作中起到重要作用［4-6］。然而16S rRNA基因区分细菌的能力仅限于种的水平［7］，菌株之间的差异往往难以通过16S rRNA基因序列的分析做出判断。因此，我们试图通过分析同种不同株之间V.parahaemolyticus 16S rRNA基因序列的差异，找出可以用于株间差异分析的靶点。为此，对作者所在实验室近年来分离自生鲜水产品中的111株V.parahaemolyticus的16S rRNA基因进行了测序分析，通过比对序列分析基因的变异规律，并通过ERIC-PCR的方法对菌株间的差异进行了验证，为水产品中副溶血性弧菌风险评估分型溯源奠定研究基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

本研究所用的V.parahaemolyticus O3：K6购自中国科学院微生物研究所，其余111株由上海海洋大学农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室分离并保藏。

PCR仪：德国eppendorf公司；电泳仪、凝胶成像系统：美国Bio-rad公司；Synergy多功能酶标仪：美国Biotek公司；超净台、生物安全柜：荷兰ESCO公司；Elix/Rios纯水系统：美国Millipore公司。

1.2副溶血性弧菌的分离和鉴定

生鲜水产品河虾和南美白对虾 （分别记为a，b），于2013年4～7月采集自上海3个主要的水产市场（分别记为A，B，C）。分别称取每个样品25 g至均质袋，加入 225 mL碱性蛋白胨水（Alkaline Peptone Water，APW）培养液拍打2 min，记为样品原液。吸取1 mL原液至9 mL APW中，依次10倍稀释7个梯度，每个梯度3个平行，37℃、170 r/min摇床培养18 h。每支试管挑取一环划线至科玛嘉弧菌显色培养基平板上，37℃倒置培养24 h。每个平板挑取3个菌落划线至胰蛋白胨大豆琼脂培养基（Tryptic Soy Agar，TSA）平板，37℃倒置培养24 h。每个TSA平板挑取1个单菌落至胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Tryptic Soy Broth，TSB）试管中，37℃、170 r/min摇床培养12 h。吸取2mL菌液提取细菌基因组DNA进行tdh、trh和tlh基因PCR鉴定。鉴定为阳性的TSB管吸取1mL菌液，混入1 mL甘油冻入-80℃冰箱保存。

1.3细菌基因组DNA的制备

实验用菌株使用前由-80℃冰箱中取出，室温解冻，用含3%NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）液体培养基活化两次，划线于TCBS琼脂培养基平板，37℃倒置培养至有单菌落形成。挑取单菌落至含3%NaCl的TSB液体培养基，180 r/min、37℃过夜培养。使用TIANgen细菌基因组提取试剂盒提取菌株基因组DNA，经过琼脂糖凝胶电泳和酶标仪对获得基因组DNA进行简要的定性定量分析。

1.4细菌16S rRNA基因的制备及系统发育分析

细菌 16S rRNA基因扩增使用常用的 27F/ 1492R引物对，反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环数为25。扩增PCR产物纯化后交由上海生工生物工程有限公司测序。使用Geneious软件对所得序列进行拼接、比对工作。将测序结果提交到GenBank数据库中获得基因登录号，通过BLAST进行相关的序列搜索，获得相似基因的序列。用MEGA v.5.0软件建立系统发育树，进化距离采用neighboor-joining法，进化树分支的置信度采用bootstrap法，重复次数为1 000。

1.5细菌基因组ERIC-PCR分型

在对所测111株V.parahaemolyticus 16S rRNA基因序列分析的基础上，选取变异度较大的8株、保守性较好的7株V.parahaemolyticus以及O3：K6作为研究对象，对其基因组进行ERIC-PCR扩增，比较菌株之间的差异。ERIC-PCR引物序列为ERIC-F：ATGTAAGCTCCTGGGATTCAC；ERIC-R：AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG。ERIC-PCR ERIC-PCR扩增所用引物由生工生物技术有限公司合成。PCR反应条件为：95℃预变性7min，94℃变性1min，52℃退火1min，65℃延伸8min，循环数为30。ERIC-PCR扩增产物用2 g/dL琼脂糖凝胶进行检测，120 V、30min，溴化乙锭染色15 min，Bio-Rad凝胶成像仪进行拍照，用Image Lab软件分析图谱。上述实验在相同条件下重复一次。电泳结果使用Image lab软件进行条带分析，同一位置条带阳性记为“1”，阴性记为“0”，NTSYS 2.10e软件进行聚类分析。

2　结果与分析

2.116S rRNA基因序列比对结果及分析

将实验室分离自生鲜水产品的111株V.parahaemolyticus的 16S rRNA基因序列与V.parahaemolyticus标准菌株RIMD2210633 strain O3：K6的16S rRNA基因序列进行比对，结果显示在整个16S rRNA基因长1 465 bp的区域内，所有序列的相似度均在97%以上，证明所有分离的菌株均为副溶血性弧菌。相似度较低的序列（97%～99%）为：514（Ab422）、516（Ab533）、517（Ab431）、518（Ba221）、523（Ba222）、556（Bb331）、557（Ab523）、567（Bb413），见图1。

观察序列比对结果可以发现，大部分序列差异主要集中在16S的V1（69～99 bp）和V2（137-242）区。由于序列间的差异较大，序列拼接结果中有多个空位存在，在50～270 bp的区域内，有38个位点的碱基的相似度＜30%，103个位点的碱基的相似度在30%～100%之间。在V3区519 bp处 （对应V.parahaemolyticus 16S rRNA基因标准序列中464 bp，下同）的碱基85.7%为G，22.3%为A。V8区1 326 bp（1 266 bp）的碱基也有比较明显的差异，为49.4%的序列在此的碱基为A，其余50.6%的序列在此为G。另外，由于少数菌株的序列差异，在比对形成的保守序列中有多处空位的存在。其中比较有特点的除了上述8株（identity低于99%）在V1和V2区形成的多处空位之外，还有 531（Cb411）、615（Cb421）和644（Bb311），由于它们在V3区的序列差异，分别在522 bp（467 bp）和535 bp（479 bp）处形成了2个明显的gap。菌株621（Aa311）在987 bp（928 bp）和992 bp（933 bp）处也有明显的两处空位。

目前在研究菌群结构多样性分析方面，多采用PCR-DGGE技术对其进行分析，大多数研究都是扩增16S rRNA的V3可变区进行DGGE指纹图谱分析［8-13］。近年来，也有关于比较扩增16S rRNA不同区域进行DGGE分析的报道［14］。根据我们的实验结果，在副溶血性弧菌的分型和多样性研究工作中，V1和V2区比V3区具有更好的变异性，可能更适合PCR-DGGE的分型和多样性分析工作。

2.2变异度较大菌株变异规律分析及其ERICPCR聚类分析

通过16S序列比对，编号为514（Ab422）、516（Ab533）、517（Ab431）、518（Ba221）、523（Ba222）、556（Bb331）、557（Ab523）、567（Bb413）的8株菌与包括RIMD2210633标准菌株在内的其他菌株具有较大差异。此8株副溶血性弧菌的相似度均在97% -99%之间，而其他菌株的相似度均在99%以上。另外，从菌株16S rRNA基因序列比对结果也能明显看出，此8株菌的16S rRNA基因序列在V1和V2区与其他序列具有较大差异。对此，我们通过建立系统发育树比较其序列的差异性。选取此8株菌和其他7株差异较小的菌株（相似度＞99%）以及O3：K6标准菌株，基于这16株菌的16S rRNA基因序列建立系统发育树，见图2。实验中所选取的差异较小的 7株菌株编号分别为：648（Ab421）、623（Ba532）、638（Aa211）、651（Bb621）、566（Ab613）、564（Cb611）、513（Ca521）。由系统发育树可知，此16株菌均属于弧菌属，与它们亲缘关系较近的多数为副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和天蓝色弧菌（Vibrio azureus）。虽然在这16株菌虽然存在不同程度的序列变异，但是通过16S rRNA基因序列系统发育分析，它们仍可被归为弧菌属的菌种。

图1　标准菌株RIMD2210633与111株V.parahaemolyticus 16SrRNA基因序列比对结果Fig.1　A lignment of 16S rRNA gene of V.parahaemolyticus RIMD2210633 and 111 strains of V.parahaemolyticus isolated from aquatic products

选取此8株菌和其他7株差异较小的菌株（相似度＞99%）以及O3：K6标准菌株进行ERIC-PCR扩增。ERIC-PCR经过一次重复，两次实验结果较为一致。ERIC-PCR电泳结果条带清晰，大部分菌株的相似度系数在0.9以下，菌株间区分度较好，见图3。结果表明，这些菌株在基因组的水平上也存在较大的差异，通过ERIC-PCR的方法也能较好的对这些菌株加以区分，也说明分离自不同样品中的副溶血性弧菌的16S rRNA基因序列存在相对较大程度的差异。另外，我们发现使用ERIC-PCR对全基因组进行聚类分析时，聚类结果和样品采集地、样品种类也存在一定的对应关系。若以相似性系数0.75为阈值，可将16株菌分为4大类，其中E1包含的6株菌种有4株分离自市场B，4株分离自南美白对虾样品；E2包含的8株菌种有5株分离自市场A，此5株菌均分离自南美白对虾样品。此规律有可能为菌株溯源工作提供一条新的思路。

图2　基于16株副溶血性弧菌16S rRNA的系统发育树Fig.2　Phylogenetic tree of 16 strains of V.parahaemolyticus and related bacterial species constructed according to 16S rRNA gene sequence

图3　ERIC-PCR指纹图谱及聚类分析树状图Fig.3　ERIC-PCR fingerprints and cluster analysis results

3　结语

16S rRNA基因序列常被用来鉴定细菌的种类［15-16］、推断细菌系统发育［17-18］和进化关系以及进行细菌群落多样性分析［19-20］等，但是目前很少有针对同种不同株细菌的16S rRNA进行变异规律分析的研究。因此，通过比较不同株V.parahaemolyticus 16S rRNA基因之间的差异，总结其变异规律，为副溶血性弧菌菌株分型工作提供新的研究靶点。通过16s rRNA基因序列比对，发现V.parahaemolyticus 16S rRNA基因序列的变异主要集中在50～270 bp的区域，也就是16S rRNA基因的V1和V2可变区，有将近一半的碱基位点相似度低于50%。而其他区域的保守性相对较高，只有V3和V8区的两个碱基位点有相对明显的变异规律。综上所述，虽然同为副溶血性弧菌，不同株的16S rRNA基因序列仍具有一定的变异性，尤其在V1和V2区的序列具有较为明显的变异。在开发副溶血性弧菌菌株分型研究新靶点时，可以在V1和V2区的位点加以尝试。V1和V2区的序列特征在涉及副溶血性弧菌16S rRNA基因序列的工作中，特别是讨论不同菌株之间的差异时具有重要的意义。

作者对分离自不同样品和采集地的大量的副溶血性弧菌进行了16S rRNA序列分析以及ERICPCR聚类分析，发现了16S rRNA基因变异规律，以及ERIC-PCR的聚类分析结果与样品采集地、样品种类的对应关系，或可为副溶血性弧菌的溯源及进化分析提供新的线索，为水产品中副溶血性弧菌风险评估分型溯源奠定研究基础。

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会议信息

会议名称（中文）：第十三届全国生物无机化学学术会议

所属学科：无机化学，化学生物学，生物物理学、生物化学及分子生物学

开始日期：2016-10-13结束日期：2016-10-16

所在城市：上海市黄浦区

主办单位：中国化学会、国家自然科学基金委

协办单位：

承办单位：上海师范大学

全文截稿日期：2016-08-15

联系人：杨红、周治国、田启威、安璐

联系电话：021 64322343、64328981

E-MAIL：cbic2016@163.com

会议网站：http://www.chemsoc.org.cn/news/？hid=1720

会议背景介绍：由中国化学会和国家自然科学基金委主办、上海师范大学承办的“中国化学会第十三届全国生物无机化学学术会议”拟定于2016年10月13-16日在上海市召开。会议主题为“化学与健康”，以学术交流为平台，通过大会报告、邀请报告、口头报告和墙报展讲等形式，充分展示和回顾近两年来我国生物无机化学及相关研究领域取得的新方法和新成果，加强生物无机化学及相关领域的学术交流，讨论生物无机化学未来发展的新思路、新领域和新趋势，促进各方面的合作和创新。内容涵盖金属酶模拟和性质研究、金属（离子）在生命体的作用、纳米材料的生物作用等各个方面。热忱欢迎广大化学工作者积极参加，踊跃投稿。同时，欢迎相关企业、高校、科研院所积极参与会展。

Sequence Variation Regularity Analysis of 16S rRNA Gene of Vibrio parahaemolyticus

FENG Bo1，2，3，LAN Ying1，2，3，SUN Xiaohong1，2，3，ZHANGWeijia1，2，3，PAN Yingjie1，2，3，ZHAO Yong*1，2，3
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Shanghai EngineeringResearchCenter of Aquatic-Product Processing&Preservation，Shanghai 201306，China；3. Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for Aquatic-Products on Storage and Preservation（Shanghai），M inistry of Agriculture，Shanghai 201306，China）

In order to lay a foundation for the developmentof new targets for typing and tracing，we investigated the characteristics of the variations based on the analysis of 16S rRNA gene sequences of Vibrio parahaemolyticus.We sequenced 16S rRNA gene of 111 strains of Vibrio parahaemolyticus which were isolated from fresh aquatic products，and aligned w ith standard sequence in GenBank. We also established phylogenetic tree of sequences which had a great variation，and verified the variation regularity of thegenesby ERIC-PCR.The variability of different Vibrio parahaemolyticus of 16S rRNA genes was discovered.The variation mainly centralized in variable region V1 and V2.There were 38 base siteswhich sim ilarity were less than 30%in the region of 50～270 bp，and 103 base siteswhich sim ilarity ranged from 30%to 100%.In addition，therewas one basewhich showed difference both at V3 and V8.The variability of different Vibrio parahaemolyticus of 16S rRNA genes can lay a foundation for the development of new targets for typing and tracing of Vibrio parahaemolyticusand for the study ofmicro-evolution.

Vibrioparahaemolyticus，16SrRNAgene，ERIC-PCRclusteranalysis，variation regularity analysis

TQ 920.6

A

1673—1689（2016）09—0928—07

2014-09-27

国家自然科学基金项目（31271870）；上海市科委部分地方院校能力建设项目（11310501100）；上海市科委科技创新行动计划项目 （12391901300）；上海市科技兴农重点攻关项目 （沪农科攻字2014第3-5号）；上海市科委工程中心建设项目（11DZ2280300）。

冯博（1989—），男，安徽蚌埠人，食品科学与工程博士研究生。E-mail：fengbo0509@126.com

赵勇（1975—），男，湖北黄冈人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事食品安全方面的研究。E-mail:yzhao@shou.edu.cn