杨莹 王光平 温斯健 宋昊 王小坡 张韡 孙建方

·论著·

趋化因子受体4、7在皮肤黑素瘤、色素痣组织中的表达及意义

杨莹 王光平 温斯健 宋昊 王小坡 张韡 孙建方

目的 探讨皮肤黑素瘤和色素痣组织中趋化因子受体4（CXCR4）和趋化因子受体7（CXCR7）的表达及其与病理特征的相关性。方法 免疫组化法检测CXCR4、CXCR7在两个组（黑素瘤组及色素痣组）中的表达情况。结果 黑素瘤组与色素痣组免疫组化比较：CXCR4分别是20%（8/40）和50%（20/40）为（-）；12.5%（5/40）和42.5%（17/40）为（+）；32.5%（13/40）和7.5%（3/40）为（++）；35%（14/40）和0%（0/40）为（+++）；差异有统计学意义（均P＜ 0.05）。CXCR7分别是15%（6/40）和35%（14/40）为（-）；10%（4/40）和62.5%（25/40）为（+）；22.5%（9/40）和2.5%（1/40）为（++）；52.5%（21/40）和0为（+++）；差异有统计学意义（均P＜ 0.05）。CXCR4的表达水平在年龄、性别、Breslow厚度、溃疡情况、淋巴细胞浸润情况分组中差异无统计学意义（P＞0.05）；在发病部位、Clark分级、淋巴结转移分组中差异有统计学意义（P＜0.05）；CXCR7的表达水平在年龄、性别、溃疡情况、淋巴细胞浸润情况、淋巴结转移分组中差异无统计学意义（P＞0.05）；在发病部位、Breslow厚度、Clark分级分组中差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 皮肤黑素瘤和色素痣组织标本中，CXCR4和CXCR7有不同程度的表达，CXCR4和CXCR7可能参与黑素瘤的发生发展。

黑色素瘤；痣；免疫组织化学；受体，CXCR4；受体，CXCR7

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81272992）；Postgraduate Innovation Fund of Peking Union Medical College（201410023005）

亚洲人黑素瘤的平均年发病率相比白色人种较低，2005—2007年我国的发病率1/10万，每年新发病例约2万人［1］。黑素瘤一旦发生转移，5年生存率仅14%［2］。目前认为，恶性肿瘤的特异性转移可能与肿瘤细胞的趋化性相关，趋化因子及其受体可能参与了恶性肿瘤的转移［3］。趋化因子受体（CXCR）4及其配体CXCL12（SDF⁃1）是人趋化因子家族中的成员之一。以往研究认为，CXCR4是CXCL12的唯一受体，近来研究发现，CXCR7是CXCL12的另一趋化因子受体［4］。李小静等［5］研究显示，CXCR7在基底细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤黑素瘤中的表达阳性率逐渐升高，与肿瘤的恶性程度一致。为探讨皮肤黑素瘤、色素痣组织中CXCR4和CXCR7的表达及其与黑素瘤临床病理特征的相关性，我们用免疫组化法检测皮肤黑素瘤和色素痣石蜡切片中CXCR4和CXCR7的表达，将同一组织标本进行连续性切片观察CXCR4和CXCR7的表达模式及表达强度，并进行分析。

1 资料与方法

1.1 资料：

1.1.1 组织来源：皮肤黑素瘤和色素痣石蜡标本来自中国医学科学院皮肤病医院病理科切片库，按照切片编号（2013年8月至2015年8月），分为40例黑素瘤组和40例色素痣组，标本均经临床、组织病理或免疫病理证实诊断。选用的组织标本用切片机进行连续性切片后用于HE染色及不同抗体的检测，制片后备用。40例皮肤黑素瘤患者中，男18例，女22例；年龄32～84岁，平均60.4岁；肢端皮肤黑素瘤33例，非肢端皮肤黑素瘤7例；ClarkⅠ～Ⅱ级18例，Ⅲ～V级22例。40例色素痣组织均为普通色素痣。

1.1.2 主要试剂：CXCR4抗体购自美国RD公司，CXCR7抗体购自英国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的二抗、免疫组化Max Vision试剂、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。

1.2 方法：HE染色和免疫组化法按常规方法操作。结果判定：与同一批连续切片后制片的HE切片、阴性对照切片对照观察以排除黑素对结果判定的干扰，在高倍镜（×400）下随机选择5个视野，着色强度：深褐色为3分，棕黄色为2分，浅黄色为1分，不着色或着色不清为0分。阳性细胞：＞50%计3分，10%～50%计2分，＜10%计1分，不着色计0分，将所计分数相乘得出免疫组化积分，0分计（-），1～3分计（+），4～6分计（++），6～9分计（+++）。结果由两位皮肤病理医师独立判断，取均值。

1.3 统计学方法：用SPSS20.0软件包进行数据分析。双向有序且属性相同的列联表分析用Kappa检验，单向有序列联表等级资料之间的比较用Mann⁃Whitney U秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCR4与CXCR7的表达：CXCR4在黑素瘤和色素痣组织中有胞质或胞核的表达，而CXCR7在黑素瘤和色素痣组织中有胞质的表达。在黑素瘤标本中，CXCR4和CXCR7的阳性表达率分别为80%（32/40）和85%（34/40）；在色素痣标本中，CXCR4和CXCR7的阳性表达率分别为50%（20/40）和65%（26/40）。两组比较，CXCR4和CXCR7的表达差异有统计学意义（均P＜0.01），见表1。黑素瘤组织标本中，CXCR4和CXCR7多呈中、高表达，色素痣组织标本中，CXCR4和CXCR7多呈阴性表达、低表达（图1，2，表1）。

表1 CXCR4、CXCR7在黑素瘤与色素痣组织标本中的表达［例（%）］

2.2 CXCR4与CXCR7表达的一致性分析：Kappa检验法进行一致性分析，结果显示，黑素瘤组织标本中，Kappa值=0.393＜0.4，说明两者的一致性较差，P＜0.001。在色素痣组织标本中，0.4＜Kappa值=0.507＜0.7，说明两者的一致性一般，P＜0.01。

2.3 CXCR4与CXCR7的表达与临床病理特征的关系：以患者年龄、性别、发病部位、Breslow厚度、Clark分级、溃疡情况、淋巴细胞浸润情况、淋巴结转移情况分组后进行分析。CXCR4表达在年龄、性别、Breslow厚度、溃疡情况、淋巴细胞浸润情况分组中差异无统计学意义（P＞0.05），但在发病部位、Clark分级、淋巴结转移分组中差异有统计学意义（均P＜0.05），且CXCR4在非肢端、ClarkⅢ ～ V级、淋巴结转移分组中呈高表达，见表2。CXCR7表达在年龄、性别、溃疡情况、淋巴细胞浸润情况、淋巴结转移分组中差异无统计学意义（均P＞0.05），但在发病部位、Breslow厚度、Clark分级分组中差异有统计学意义（均P＜0.05），且CXCR7在非肢端、Breslow厚度＞1.00 mm、ClarkⅢ～V级分组中呈高表达，见表3。

图1 黑素瘤组织标本中，CXCR4在胞质和胞核中呈高表达，CXCR7在胞质中呈高表达（免疫组化×200） 1A：HE染色；1B：CXCR4阳性染色；1C：CXCR7阳性染色；1D：阴性对照

图2 色素痣组织标本CXCR4在胞质和胞核中呈低表达，CXCR7在胞质中呈低表达（免疫组化× 200） 2A：HE染色；2B：CXCR4阳性；2C：CXCR7阳性；2D：阴性对照

表2 趋化因子受体4与黑素瘤临床病理学特征的关系（例数）

表3 趋化因子受体7与黑素瘤临床病理学特征的关系（例数）

3 讨论

CXCR4及其配体CXCL12在肿瘤细胞的扩散及转移中具有特殊的重要性，目前至少有23种不同的肿瘤细胞表达CXCR4［6］。研究发现，黑素瘤组织CXCR4的表达与肿瘤进展及预后相关［7⁃9］，黑素瘤细胞表达的CXCR4参与肿瘤的发生与转移过程［10⁃11］，过表达CXCR4的小鼠B16黑素瘤细胞向小鼠肺内转移的能力增强［12］。以往的研究认为，CXCR4是CXCL12的唯一受体，然而新的研究发现，CXCL12的另一趋化因子受体CXCR7［4］，又名非典型趋化因子受体3（ACKR3）。研究发现，黑素瘤细胞也表达CXCR7，且与非侵袭性黑素瘤细胞比较，侵袭性黑素瘤细胞呈过表达CXCR7［13］，体内试验中抑制CXCR7而不是CXCR4b能延缓青鳉鱼黑素瘤模型的肿瘤进展［14］。因此，CXCR4和CXCR7在黑素瘤进展中发挥的具体作用目前尚存不同意见，有待进一步研究。

本研究中，以皮肤黑素瘤及色素痣组织的石蜡标本切片作为研究对象，应用免疫组化法分别检测CXCR4和CXCR7的表达，与同一批连续切片后制片的HE切片、阴性对照切片对照观察以排除黑素对结果判定的干扰。研究显示，在皮肤黑素瘤和色素痣组织标本中，CXCR4和CXCR7有不同程度的表达，CXCR4和CXCR7在皮肤黑素瘤组织中较多呈中、高表达，在色素痣组织标本中较多呈阴性表达、低表达。这一结果提示，CXCR4和CXCR7可能参与黑素瘤的发生发展，为后续研究提供了理论基础。然而，本研究结果显示，CXCR4和CXCR7的表达水平在黑素瘤组织中的一致性较差，在色素痣组织标本中的一致性一般，提示CXCR4和CXCR7的表达水平在黑素瘤、色素痣中可能无明显相关。

但是，本研究结果显示，CXCR4的表达与发病部位、Clark分级、淋巴结转移相关，在非肢端、ClarkⅢ～V级、淋巴结转移分组中呈高表达，CXCR7的表达水平与发病部位、Breslow厚度、Clark分级相关，在非肢端、Breslow厚度＞1.00 mm、ClarkⅢ～V级分组中呈高表达，提示CXCR4、CXCR7的表达水平与黑素瘤预后相关，CXCR4和CXCR7的高表达可能在一定程度上提示肿瘤更高的恶性程度和预后不良。然而，我们的研究结果与既往研究有相似也有不同之处。Longo⁃Imedio等［7］研究显示，黑素瘤患者CXCR4的表达水平与肿瘤出现溃疡、肿瘤厚度大、肿瘤发生转移、患者高死亡率呈正相关。Toyozawa等［8］研究显示，CXCR4高表达与肿瘤厚度、结节型及远处转移相关。而Scala等［9］研究显示，CXCR4的表达水平与年龄、性别、部位、Breslow厚度、Clark分级、溃疡、结节型、淋巴结转移等上述临床病理参数无关，但与患者的无病生存期及总生存期相关，同样认为黑素瘤患者高表达CXCR4提示预后不良。Salmaggi等［15］在原发部位为肺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌及黑素瘤的脑转移癌标本中检测CXCR4和CXCR7的表达，未能发现二者的表达水平与不良预后相关。但遗憾的是，我们的研究没有包括远期生存及复发的随访资料，不能直接证明CXCR4和CXCR7的表达与不良预后直接相关，扩大样本量以及进行Kaplan⁃Meier生存分析有助于证实CXCR4和CXCR7的预后价值。

志谢中国医学科学院皮肤病医院病理科李阿梅、邵雪宝、程伟、臧洁老师

［1］CSCO黑色素瘤专家委员会.中国黑色素瘤诊治指南（2011版）［J］.临床肿瘤学杂志,2012,17（2）:159⁃171.DOI:10.3969/j.issn.1009⁃0460.2012.02.015.

［2］Miller AJ,Mihm MC.Melanoma［J］.N Engl J Med,2006,355（1）:51⁃65.DOI:10.1056/NEJMra052166.

［3］Roussos ET,Condeelis JS,Patsialou A.Chemotaxis in cancer［J］.Nat Rev Cancer,2011,11（8）:573⁃587.DOI:10.1038/nrc3078.

［4］Burns JM,Summers BC,Wang Y,et al.A novel chemokine receptor for SDF⁃1 and I⁃TAC involved in cell survival,cell adhesion,and tumor development［J］.J Exp Med,2006,203（9）:2201⁃2213.DOI:10.1084/jem.20052144.

［5］李小静,刘排,陈浩,等.CXCR7在常见皮肤恶性肿瘤及其细胞株中的表达及意义［J］.中华皮肤科杂志,2011,44（12）:854⁃856.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2011.12.011.

［6］Lazennec G,Richmond A.Chemokines and chemokine receptors:new insights into cancer⁃related inflammation［J］.Trends Mol Med,2010,16（3）:133⁃144.DOI:10.1016/j.molmed.2010.01.003.

［7］Longo⁃Imedio MI,Longo N,Treviño I,et al.Clinical significance of CXCR3 and CXCR4 expression in primary melanoma［J］.Int J Cancer,2005,117（5）:861⁃865.DOI:10.1002/ijc.21269.

［8］Toyozawa S,Kaminaka C,Furukawa F,et al.Chemokine receptor CXCR4 is a novel marker for the progression of cutaneous malignant melanomas［J］.Acta Histochem Cytochem,2012,45（5）:293⁃299.DOI:10.1267/ahc.12004.

［9］Scala S,Ottaiano A,Ascierto PA,et al.Expression of CXCR4 predicts poor prognosis in patients with malignant melanoma［J］.Clin Cancer Res,2005,11（5）:1835⁃1841.DOI:10.1158/1078⁃0432.CCR⁃04⁃1887.

［10］Robledo MM,Bartolome RA,Longo N,et al.Expression of functional chemokine receptors CXCR3 and CXCR4 on human melanoma cells［J］.J Biol Chem,2001,276（48）:45098⁃45105.DOI:10.1074/jbc.M106912200.

［11］Scala S,Giuliano P,Ascierto PA,et al.Human melanoma metastases express functional CXCR4［J］.Clin Cancer Res,2006,12（8）:2427⁃2433.DOI:10.1158/1078⁃0432.CCR⁃05⁃1940.

［12］Murakami T,Maki W,Cardones AR,et al.Expression of CXC chemokine receptor⁃4 enhances the pulmonary metastatic potential of murine B16 melanoma cells［J］.Cancer Res,2002,62（24）:7328⁃7334.

［13］WidmerDS,ChengPF,EichhoffOM,etal.Systematic classification of melanoma cells by phenotype⁃specific gene expression mapping［J］.Pigment Cell Melanoma Res,2012,25（3）:343⁃353.DOI:10.1111/j.1755⁃148X.2012.00986.x.

［14］Liedtke D,Erhard I,Abe K,et al.Xmrk⁃induced melanoma progression is affected by Sdf1 signals through Cxcr7［J］.Pigment Cell Melanoma Res,2014,27（2）:221 ⁃233.DOI:10.1111/pcmr.12188.

［15］Salmaggi A,Maderna E,Calatozzolo C,et al.CXCL12,CXCR4 and CXCR7 expression in brain metastases［J］.Cancer Biol Ther,2009,8（17）:1608⁃1614.

Expressions of chemokine receptors 4 and 7 in cutaneous malignant melanoma and pigmented nevus tissues and their significance

Yang Ying,Wang Guangping,Wen Sijian,Song Hao,Wang Xiaopo,Zhang Wei,Sun Jianfang.Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

Objective To measure expressions of chemokine receptor 4（CXCR4）and CXCR7 in cutaneous malignant melanoma（CMM）and pigmented nevus tissues,and to explore their correlations with pathological features.Methods Skin specimens were obtained from the lesions of 40 patients with CMM（CMM group）and 40 patients with pigmented nevus（pigmented nevus group）.An immunohistochemical study was performed to measure expressions of CXCR4 and CXCR7 in these specimens.Results In the CMM group,8（20.0%）and 6（15.0%）specimens were negative（-）,5（12.5%）and 4（10.0%）mildly positive（+）,13（32.5%）and 9（22.5%）moderately positive（++）,14（35.0%）and 21（52.2%）strongly positive（+++）,for CXCR4 and CXCR7 respectively.Of the pigmented nevus specimens,20（50.0%）and 14（35.0%）were negative（-）,17（42.5%）and 25（62.5%）mildly positive（+）,3（7.5%）and 1（2.5%）moderately positive（++）,for CXCR4 and CXCR7 respectively,but none was strongly positive（+++）for either of them.There were significant differences in the expressions of CXCR4 and CXCR7 between the CMM group and pigmented nevus group（U=317,256.5,respectively,bothP＜ 0.01）.The expression of CXCR4 was significantly higher in non⁃acral than in acral melanomas（U=38,P＜ 0.05）,higher in Clark’s levelⅢ－Ⅴ than inⅠ－Ⅱ melanomas（U=116,P＜ 0.05）,and higher in melanoma tissues from patients with lymphatic metastasis than in those without（U=16.5,P＜ 0.05）,but similar among patients of different age or gender,and among melanomas with different Breslow thickness,degrees of ulceration or lymphocytic infiltration（allP＞ 0.05）.No significant difference was observed in the expression of CXCR7 among patients of different age,gender,or among melanomas with different degrees of ulceration or lymphocytic infiltration,or between melanoma tissues from patients with lymphatic metastasis and those without（allP＞ 0.05）,but it was significantly higher in non⁃acral than in acral melanomas（U=64,P＜0.05）,higher in melanomas with Breslow thickness＞1.00 mm than in those≤1.00 mm（U=81.5,P＜ 0.05）,and higher in Clark’s levelⅢ－Ⅴ than inⅠ－Ⅱmelanomas（U=60.5,P＜ 0.05）.Conclusion Both CXCR4 and CXCR7 are expressed to different extents in CMM and pigmented nevus tissues,suggesting that they may participate in the occurrence and development of CMM.

Melanoma;Nevus;Immunohistochemistry;Receptors,CXCR4;Receptors,CXCR7

国家自然科学基金（81272992）；北京协和医学院研究生创新基金（201410023005）

10.3760/cma.j.issn.1673⁃4173.2016.06.001

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院病理科

孙建方，Email：fangmin5758@aliyun.com

2016⁃042⁃22）