张曦媛，孟建宇

（内蒙古农业大学生命科学学院应用与环境微生物研究所，内蒙古 呼和浩特 010018）

盐碱湖耐盐菌菌株MIM19的生理生化特性分析

张曦媛，孟建宇

（内蒙古农业大学生命科学学院应用与环境微生物研究所，内蒙古 呼和浩特 010018）

对分离自内蒙古浑善达克盐碱湖的1株耐盐菌MIM19的生理生化特性进行了研究。结果表明，该菌为革兰阴性杆菌，菌落呈粉红色，可分泌酯酶、脲酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶，能够液化明胶，还原亚硝酸盐。

盐碱湖；耐盐菌；生理生化特性

地球表面广泛存在的大面积盐水环境为一种喜盐微生物，即耐盐菌的出现与进化提供了极为有利的条件［1］，该种高盐环境包括盐湖、盐碱湖以及死海等浓缩海水［2-3］。目前，对耐盐菌的研究主要集中在其产生的大分子多聚物、生物活性物质以及这些物质在生物环保中的应用等方面［4-5］。另外，耐盐菌对高盐环境广泛而强大的适应能力以及耐盐菌的生理特性和代谢机制的特殊性，也使之成为人们分离、筛选新的活性物质的主要来源之一［6-7］。

内蒙古地区分布有广泛的盐碱湖系统，其中蕴藏着丰富的微生物资源，利用这些微生物资源对盐碱湖进行治理、改造和合理开发利用，可为生态可持续发展提供新途径［8-9］。在对高盐环境长期适应的微生物群体中，逐渐进化出了较为特殊的耐盐机制［10-11］。同时，针对湖泊与土壤的盐碱化对生产与生态带来极大不良影响的现状，如何结合微生物改良手段，如转耐盐基因植物的改造或微生物菌肥的开发等手段［12］，有效开展盐碱地与盐湖系统的治理、改造工作，提升其经济与生态效益，已成为当今环境与生态科学的研究热点问题之一［13-15］。为此，该研究对分离自内蒙古地区盐碱湖的耐盐菌株MIM19的生理生化特性进行了分析，以期为后期耐盐微生物菌剂的研究与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 耐盐菌菌株：耐盐菌菌株MIM19由内蒙古农业大学生命科学学院应用与环境微生物研究所提供。

1.1.2 培养基：

①液体培养基：酵母粉0.5 g/L，蛋白胨2.5 g/L，MgCl24.4 g/L，KCl 0.275 g/L，Na2SO31.62 g/L，CaCl20.9 g/L，NaHCO30.08 g/L，柠檬酸铁0.05 g/L，NaCl 9.76 g/L，微量元素溶液5 mL/L，pH值为9～10，蒸馏水1 000 mL。

②微量元素溶液配方：FeCl30.05 g/L，MnSO4· H2O 0.02 g/L，H3BO30.01 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，（NH4）6Mo7O24·4H2O 0.02 g/L，ZnSO40.01 g/L，EDTA 0.5 g/L，CaCl2·2H2O 0.2 g/L。

③固体培养基：在液体培养基中加入琼脂20 g/L制成。

④半固体培养基：在液体培养基中加入琼脂6 g/L制成。

1.2 试验方法

1.2.1 形态特征观察：通过平板划线培养和革兰染色法，观察菌株MIM19的基本形态特征。

1.2.2 生长曲线的绘制：将MIM19菌株接种于含50 mL液体培养基的 150 mL锥形瓶中，30℃、200 r/min摇床光照培养。隔时取样，于540 nm下进行吸光度测定。以培养时间为横坐标，OD540nm值为纵坐标绘制生长曲线。

1.2.3 生理生化特性：

①酯酶：划线接种于Tween 20终浓度为1%的固体培养基中，33℃光照培养，每天观察。

②苯丙氨酸脱氢酶：在固体培养基中加入0.2 g DL-苯丙氨酸，冷却至40～50℃，接种，适温培养；滴加10%（W/V）的FeCl3溶液4～5滴于生长菌的培养基上，观察培养基表面和冷凝水的颜色。

③精氨酸双水解酶：在半固体培养基中加入1 g L-精氨酸盐分装试管4～5 mL，冷却至40～50℃，用幼龄菌穿刺接种，适温培养3、7、14 d，观察试验结果。

④赖氨酸脱羧酶：在半固体培养基中加入1 g L-赖氨酸分装试管3～4 mL，121℃灭菌10 min，冷却，接种，30℃培养箱培养7 d。取62.5 μL浓度为1.6%的溴甲酚紫及250 μL浓度为0.2%的甲酚红作为指示剂，观察试验结果。

⑤脲酶：配制固体培养基，在菌液中滴加1滴酚红试剂，调pH值至9.0。在其中1份菌液中加0.1 g尿素，另1份不加作为对照，观察颜色变化。倒平板，冷却至40～50℃，接种，适温培养。

⑥甲基红：将菌株接种于液体培养基中适温培养2～6 d；在菌液中滴加1滴甲基红试剂，观察试验结果。

⑦淀粉水解：菌株接种于含0.2%可溶性淀粉的固体培养基上，适温培养2～5 d，形成菌落后滴加卢哥氏碘液，观察试验结果。

⑧明胶液化：将固体培养基中的琼脂换成10～15 g明胶分装试管 4～5 cm，115℃间歇灭菌20 min。取培养物穿刺接种，设空白对照，20℃温箱培养2、7、10、14 d。置于20℃以下环境中，观察是否凹陷，判断是否液化。

⑨硝酸盐还原：在液体培养基中加0.1 g KNO3分装试管4～5 cm，冷却，取培养菌穿刺接种，设空白对照，置适温培养3、5、7 d，观察试验结果。取干净试管分别倒入培养3、5、7 d的培养液后，各加入1滴格里斯氏试剂，设空白对照，观察试验结果。

⑩亚硝酸盐还原：在液体培养基中加入0.1 g NaNO2分装试管4～5 cm，冷却，取培养菌穿刺接种，设空白对照，置适温培养3、5、7 d，观察试验结果。取干净试管分别倒入培养3、5、7 d的培养液后，各加入1滴格里斯氏试剂，设空白对照，观察试验结果。

2 结果与分析

2.1 MIM19菌株的形态特征和生长曲线 菌株MIM19为革兰阴性菌，呈杆状，菌落为粉红色。根据不同发酵时间取样，对样品在540 nm下进行吸光度测定，根据OD540nm值绘制出生长曲线。由图1可以看出，0～24 h为延滞期，24～72 h为指数期，72～96 h为稳定期，120 h后为衰亡期。

图1 菌株MIM19的生长曲线

2.2 MIM19菌株的生理生化特性 对菌株MIM19进行生理生化特性分析，发现菌株MIM19可分泌酯酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶和脲酶，可水解明胶，可还原亚硝酸盐，不产生苯丙氨酸脱氢酶，甲基红试验和淀粉水解试验为阴性，不能还原硝酸盐。详细结果见表1。

表1 菌株MIM19的生理生化特性

3 结论与讨论

耐盐菌菌株MIM19是1株革兰阴性杆状细菌，菌落为粉红色。菌株培养24 h后进入指数生长期，在72 h后达到稳定期。菌株MIM19可分泌酯酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶和脲酶，不产生苯丙氨酸脱氢酶，可使明胶液化，不能水解淀粉，甲基红试验为阴性，可还原亚硝酸盐，不能还原硝酸盐。

目前，国内对耐盐菌的研究较多［16-18］。 对耐盐菌耐盐机制及生化特性的研究，无论在转基因抗盐菌株的构建还是环境修复等方面均有广阔的应用前景［19］。内蒙古地区拥有丰富的盐碱湖系统生物资源优势，是极其宝贵的基因资源，具有重大的科学研究和经济开发价值［20-21］。

［1］GUPTA S，SHARMA P，DEV K，et al.A diverse group of halophilic bacteria exist in Lunsu，a natural salt water body of HimachalPradesh，India［J］.SpringerPlus，2015，4：274.

［2］潘媛媛，黄海鹏，孟婧，等.松嫩平原盐碱地中耐（嗜）盐菌的生物多样性［J］.微生物学报，2012，52（10）：1187-1194.

［3］宋倩.内蒙古额吉淖尔盐碱湖嗜盐古菌的分离及其bop基因克隆［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2014.

［4］阎松，张翼，王珊珊.抗生活性中度嗜盐菌的筛选及菌种鉴定［J］.大连交通大学学报，2015，36（S1）：115-118.

［5］朱德锐，刘建，刘静静，等.青海湖嗜盐菌的分离与优势菌株QHL5的特性［J］.应用与环境生物学报，2012，18（5）：797-803.

［6］赵谋明，舒会，崔春，等.产耐盐蛋白酶深海细菌的分离鉴定［J］.现代食品科技，2015（3）：50-54.

［7］周芳芳，熊涛.3株中度嗜盐菌的分离鉴定与生长特性研究［J］.长江大学学报（自然科学版），2016，13（15）：59-62.

［8］陆洪省，徐莹莹，于梦梦，等.一株黄河三角洲盐碱地耐盐菌的分离、鉴定及耐盐能力分析［J］.安徽大学学报（自然科学版），2015，39（4）：103-108.

［9］张鲜姣，谢小林，陈美标，等.一株耐盐黏细菌的分离与鉴定［J］.生物技术进展，2013，3（4）：288-292.

［10］黄中子，李辉，刘勇弟，等.一株中度嗜盐菌Virgibacillu sp.PDB-F2对苯酚的降解特性［J］.环境科学与技术，2015，38（12）：1-5.

［11］殷婷婷，薛梦颖，丁丽燕，等.嗜盐细菌XJ12的分子鉴定与生长特性研究［J］.江苏农业科学，2013，41（11）：368-370.

［12］王多兵，任伟，张富春，等.盐穗木根际土壤中耐盐菌B6的分离与鉴定［J］.安徽农业科学，2013，41（3）：957-960.

［13］燕红，钟方，高新亮，等.耐盐碱菌株的分离筛选及生物学特性和盐碱去除效率的研究［J］.生态学杂志，2012，31（4）：1000-1008.

［14］沈国平，朱德锐，刘建，等.青海湖嗜盐微生物筛选分离与生长特性［J］.湖泊科学，2012，24（2）：313-319.

［15］单德鑫，李海统，黄河，等.两株高效耐盐菌的分离鉴定及生长特性研究［J］.湖北农业科学，2014，53（22）：5395-5397.

［16］张广志，周红姿，杨合同，等.盐碱土壤中耐盐细菌的分离与鉴定［J］.山东农业科学，2008（9）：49-50.

［17］吕爱军，胡秀彩，张冬杰，等.11株中度嗜盐菌的分离及生理生化特性研究［J］.安徽农业科学，2008，36（4）：1325-1326.

［18］迪力达尔克孜·吾拉木，迪丽拜尔·托乎提，刘会强，等.一株分离自艾丁湖土壤的嗜盐古菌新种的研究［J］.新疆师范大学学报（自然科学版），2014，33（1）：31-37.

［19］李俊叶，王筱兰，邹峥嵘.耐盐菌的筛选及初步鉴定［J］.安徽农业科学，2011，39（11）：6658-6660.

［20］迪丽拜尔·托乎提，徐晓晶.新疆艾丁湖及邻近地区嗜盐菌和耐盐菌的数量分布［J］.生态学报，2001，21（8）：1388-1391.

［21］王菲，刘抗，范家同，等.一株耐盐弧菌Vibrio sp.K1-L的分离与鉴定［J］.生物技术通报，2014（4）：127-131.

《畜牧与饲料科学》杂志简介

《畜牧与饲料科学》是经科技部和国家新闻出版总署批准的学术类期刊。1973年创刊，是《中国学术期刊综合评价数据库》《中国学术期刊（光盘版）》《中国核心期刊（遴选）数据库》《中文科技期刊数据库》等全文收录期刊。

主要栏目：基础科学、试验研究、水产科学、实验技术、生物工程、遗传与繁育、资源与环境、动物营养与饲料科学、草业科学、食品科学、畜牧生产、教学研究、药物科学、动物检疫、经济与管理、疾病防治、工艺设备、生态工程、特种养殖等。

国内统一连续出版物号：CN15-1228/S；国际标准连续出版物号：ISSN1672-5190。本刊为月刊，国内外公开发行。

发行方式：邮发和自办发行，邮发代号：16-101。定价15元/期，全年定价180元。可随时订阅，也可直接汇款至编辑部。

地 址：呼和浩特市昭君路22号内蒙古农牧业科学院《畜牧与饲料科学》编辑部 邮 编：010031

电 话：0471-5294608，5296179，5294500（传真） 电子信箱：cnmxky@vip.163.com 网 址：www.xmysl.cn

Physiological and Biochemical Characteristic of a Strain of Halotolerant Bacterium MIM19 Isolated from Salt Alkaline Lake

ZHANG Xi-yuan，MENG Jian-yu
（Institute for Applied and Environmental Microbiology，College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

The physiological and biochemical characteristic of a halotolerant bacterium designated as MIM19 which was isolated from the Hunshandake Salt Lake in Inner Mongolia were investigated.The results showed that the strain was found to be gramnegative and pink-pigmented bacterium.It was able to secreted lipoidase,urease,lysine decarboxylase and arginine dihydrolase, liquefied gelatin and reduced nitrite.

salt alkaline lake；halophiles；physiological and biochemical characteristic

Q93-3

A文章顺序编号：1672-5190（2016）09-0022-03

2016－08－09

项目来源：国家自然科学基金项目（31460002）；内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY14084）。

张曦媛（1994—），女，所学专业为生物工程。

孟建宇（1977—），男，副教授，主要研究方向为应用与资源微生物学。

（责任编辑：赵俊利）