魏　丽　刘萌萌　屈彩霞

郑州市第三人民院病理科，河南郑州450000

TGF-β1与α-SMA在小鼠肺纤维化模型中的表达及其相互关系

魏丽刘萌萌屈彩霞

郑州市第三人民院病理科，河南郑州450000

目的探讨转化生长因子β1（TGF-β1）与α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在小鼠肺纤维化模型中的表达，及其之间的相互关系。方法气管内灌注博莱霉素（7 mg/kg）制备肺纤维化模型，进行HE、Masson染色并采用免疫组织化学检测小鼠肺纤维化组织中TGF-β1和α-SMA的表达。结果对照组中α-SMA表达于支气管和大血管周围的平滑肌细胞，模型组中α-SMA表达于支气管、大血管周围的平滑肌细胞及成纤维细胞灶，TGF-β1表达于支气管、大血管周围的成纤维细胞、炎细胞以及成纤维细胞灶，与α-SMA表达相似。TGF-β1和α-SMA均与小鼠肺纤维化程度均呈正相关（r=0.628、0.766，P＜0.01）。TGF-β1与α-SMA呈正相关（rs=0.728，P＜0.01）。结论TGF-β1和α-SMA在肺间质纤维形成过程起到重要作用，并可能协同参与。

博莱霉素；肺纤维化；TGF-β1；α-SMA；小鼠

［Abstract］Objective To discuss the expression of and relation between TGF-β1 and α-SMA in mice pulmonary fibrosis model.Methods The pulmonary fibrosis model was prepared by intratracheal instillation of bleomycin（7 mg/kg）. The expression of TGF-β1and α-SMA in mice pulmonary fibrosis tissues was detected by HE and Masson staining and immunohistochemistry.Results In the control group，α-SMA was expressed in smooth muscle cells of bronchi and around great vessels，while in the model group，α-SMA was expressed in smooth muscle cells，fibroblasts，and fibroblast foci of bronchi and around great vessels，and the expression of TGF-β1was similar to that of α-SMA in fibroblasts and fibroblast foci of bronchioli and around great vessels.Both TGF-β1and α-SMA had positive correlation with degree of pulmonary fibrosis in mice（r=0.766，and 0.628，respectively，P＜0.01）.There was also a positive relation between TGF-β1and α-SMA（rs=0.728，P＜0.01）.Conclusion TGF-β1and A-SMA play important roles and may cooperate in formation of pulmonary interstitial fibrosis.

［Key words］Bleomycin；Pulmonary fibrosis；TGF-β1；α-SMA；Mice

肺纤维化是多种病因引起急、慢性肺泡损伤导致细胞外基质过度合成、沉积的间质性肺疾病的共同结局［1］。但其确切发病机制仍不十分清楚，且缺乏特异而有效的治疗手段［2，3］。肺纤维化中细胞外基质合成和沉积［4，5］，主要来源于肌成纤维细胞，是致纤维化的主要效应细胞，其是一个活化的成纤维细胞的亚型，表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和波形蛋白（vimentin），因此本文检测α-SMA及转化生长因子-β1（TGF-β1）在小鼠肺纤维化中的表达及其相互关系，探讨两者在肺纤维化过程中所起的作用。

1　材料与方法

1.1主要试剂

博莱霉素（BLM-A5），兔抗鼠TGF-β1单克隆抗体，鼠抗鼠α-SMA单克隆抗体，即用型SP试剂盒。

1.2动物模型制备

健康清洁级雄性ICR小鼠56只，4～6周龄、体重23～27 g，在普通级实验室条件下饲养小鼠，合适室温、良好通风，自由取食、饮水。随机分组：模型组和对照组各28只。模型组小鼠按照7 mg/kg气管内灌注博莱霉素生理盐水溶液，对照组气管灌注等体积的生理盐水。模型组和对照组在1、2、3和4周各随机断颈处死7只小鼠，剖开胸取出肺组织，放入10%中性福尔马林进行常规固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。

1.3免疫组织化学染色

测定α-SMA和TGF-β1在纤维化的小鼠肺组织中的表达：按照免疫组化试剂盒的说明书进行实验操作。主要步骤为切片逐步脱蜡至水，在室温下，3%H2O2封闭切片组织的内源性过氧化物酶30 min；在室温条件下，α-SMA和兔抗TGF-β1按照浓度1∶100孵育60 min；室温下二抗即用型SP试剂盒（北京中杉公司）孵育20 min，经DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片，用PBS缓冲液代替一抗作为空白对照。

1.4免疫组织化学结果判定

按文献［1］判定免疫反应性：在高倍镜下观察，无阳性细胞为阴性；0%＜阳性细胞占所有细胞的百分比≤10%为+；10%＜阳性细胞百分比≤50%为++；50%＜阳性细胞百分比≤100%为+++。结合染色强度综合判定。

1.5肺纤维化程度的判定

依据Szapiel等方法、HE染色和Masson染色判定：①肺纤维化1级：病变范围＜全肺20%，支气管壁均增厚，肺泡间隔明显增宽，少量成纤维细胞灶，病灶区胶原纤维沉积明显；②纤维化2级：病变范围占全肺20%～50%，与正常肺组织相比差别明显，肺组织广泛纤维化，肺泡腔变形、闭塞，成纤维细胞灶增多更明显，肺间质胶原纤维大量沉积；③纤维化3级：病变范围＞全肺50%，肺组织纤维化更重，肺泡壁明显增厚、结构破坏，间质形成纤维化瘢痕、呈条状、团状分布的胶原纤维沉积广泛，

1.6统计学处理

采用SPSS 15.0统计学软件进行Spearman秩相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1小鼠的肺组织病理特征

对照组小鼠肺组织均未见明显改变。模型组支气管灌注博莱霉素生理盐水溶液后1周：肺泡间隔增宽，少量纤维细胞增生，支气管周围及肺泡间隔以淋巴细胞浸润为主，部分小鼠肺间隔间质内有少量胶原沉积；灌注后2周：肺泡间隔增宽更加明显，支气管壁增厚，间质内可见多的成纤维细胞灶，肺胸膜增厚，胸膜下可见局灶性增生的成纤维细胞，胶原纤维沉积进一步明显；灌注后3周：肺组织内广泛纤维化，见变形、闭塞得肺泡腔，间质内成纤维细胞灶增多更明显、大量沉积的胶原纤维（封三图4、5）；灌注后4周：肺纤维化更加明显，肺泡结构破坏，间质内纤维化瘢痕形成及大量呈条状、团状的胶原纤维分布。

2.2 TGF-β1与α-SMA在肺纤维化中的表达及相关性

对照组中，TGF-β1表达于正常支气管周围的纤维细胞。而模型组中，除支气管和大血管周围成纤维细胞、炎细胞外，还表达于成纤维细胞灶，且随纤维化加重而阳性表达增强（表1）。大部分成纤维细胞灶既表达TGF-β1又表达α-SMA，并且在成纤维细胞灶中（封三图4），TGF-β1的染色指数与肺纤维化程度呈正相关（rs=0.628，P＜0.01）。TGF-β1的染色指数也与α-SMA呈正相关（rs=0.728，P＜0.01）。

对照组中，α-SMA小鼠肺组织表达于支气管和大血管周围的平滑肌细胞，在支气管黏膜上皮和肺泡上皮细胞无表达；模型组中，除表达于支气管和大血管周围的平滑肌细胞外，还表达于成纤维细胞灶，并随肺纤维化加重而表达增强（表1，封三图5），且α-SMA的染色指数与肺纤维化程度呈正相关（rs=0.766，P＜0.01）。

表1　TGF-β1和α-SMA染色指数在28只小鼠中的分布

3　讨论

许多肺慢性疾病后期的共同结局是肺纤维化，其病理特征是早期肺炎、成纤维细胞的增生及活化、胶原进行性沉积和ECM的重塑［2］。并且其中成纤维细胞灶在肺纤维化发生发展中起到至关重要作用。于是有效抑制成纤维细胞募集、成纤维细胞的持续性增殖分化及促使其凋亡可能为肺间质纤维化的治疗提供新的治疗途径，也可成为肺间质纤维化的有效治疗手段［6-8］。

博莱霉素所致的小鼠肺纤维化模型的病理学改变大致分为：炎症反应、间质细胞增生及弥漫性纤维化。在模型组中，α-SMA除表达于支气管和大血管周围的平滑肌细胞外，还表达于成纤维细胞灶，并随肺纤维化加重而表达增强，其染色指数与肺纤维化程度呈正相关，与文献报道一致［9］。而在模型组中，TGF-β1除表达于支气管和大血管周围成纤维细胞外，还表达于成纤维细胞灶且随纤维化加重而阳性表达增强。大部分成纤维细胞灶既表达TGF-β1又表达α-SMA，其染色指数与肺纤维化程度呈正相关，TGF-β1的染色指数也与α-SMA呈正相关，这也与文献一致［8］。本研究进一步证实在肺间质纤维化的发生发展过程中，TGF-β1和α-SMA是关键致纤维化因子［10，11］，在成纤维细胞持续性分化增殖的过程中也起到了至关重要的作用，并可能二者协同参与肺纤维化的形成［3］。抑制TGF-β1和α-SMA的表达或阻断其传导通路将会为肺纤维化的治疗提供新的治疗方法和手段。

肺纤维化是多种细胞和细胞因子作用的复杂网络，其中成纤维细胞/肌成纤维细胞的持续性活化、胶原纤维的代谢紊乱和细胞外基质的重塑是其病理特征。近来有研究证实在肺纤维化中成纤维细胞灶起到了至关重要作用，与肺功能异常患者的存活时间缩短有关。大量研究已经证实［7］α-SMA是活化的成纤维细胞的标记，胞浆中的α-SMA表达使其具有收缩性，其收缩特性与组织纤维化密切相关，在器官纤维化过程中起到至关重要的作用，在肺纤维化过程中也是关键的致纤维化因子，本研究也证实了这一点。

大量的研究证明TGF-β在肺纤维化的形成过程中起关键性的作用。其有三种类型：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，以TGF-β1与肺纤维化的关系最密切。TGF-β也有三种受体：TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ、TGF-βⅢ。研究证实外界刺激使TGF-β1与Ⅱ型膜受体亲和力最高，其先与Ⅱ型膜受体结合，后与Ⅰ型膜受体结合，经胞内磷酸化作用，激活Ⅰ型、Ⅱ型受体的胞内功能区域的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，将信息传递给转录调控子-Smads，调控细胞转录，促进成纤维细胞分化增殖并抑制其凋亡、EMT和生长因子等释放，从而抑制ECM的降解，导致肺纤维化。正常情况下，TGF-β1通过二硫键形成二聚体储存在细胞内，且该二聚体以共价键结合到潜在相关肽（latency-associated protein，LAP），使TGF-β1以无活性形式存在。组织蛋白酶、纤维蛋白溶解酶、钙蛋白酶、血小板反应素、整合蛋白αvβ6和基质金属蛋白酶可以裂解LAP使TGF-β1变成活性状态，从而使TGF-β1信号通路激活。有研究证实TGF-β1在成纤维细胞向肌成纤维细胞分化和增殖过程中其重要作用［12，13］。其他一些细胞因子，如结缔组织生长因子（CTGF）、IL-4、IL-13、整合蛋白αvβ6、蛋白水解受体（PAR）、血小板生长因子（PDGF）及内皮素等虽具有各自的信号转导途径促进纤维化形成，但还可协同TGF-β1促进肌成纤维细胞分化增殖和ECM沉积，从而导致肺纤维化形成［4.5，14，15］。因此，抑制TGF-β1的信号传导通路将成为抗纤维药物治疗的靶点。

总之，α-SMA和TGF-β1是肺纤维化过程的关键细胞因子，并可能协同参与肺纤维化的形成［3］，因此抑制TGF-β1和α-SMA的表达或阻断其传导通路将会为肺纤维化的治疗提供新的治疗方法和手段。

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Expression of and relation between TGF-β1and α-SMA in mice pulmonary fibrosis model

WEI LiLIU MengmengQU Caixia
Department of Pathology，Zhengzhou Third People's Hospital，Zhengzhou450000，China

R563.9

A

1673-9701（2016）22-0031-03

2016-06-15）