朱丽萍，王建萍，丁雪梅，曾秋凤，白世平，玄　玥，宿卓薇，张克英*

（四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部重点实验室，四川 成都 611130）

高效液相色谱法测定鸡蛋中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮残留量

朱丽萍，王建萍，丁雪梅，曾秋凤，白世平，玄玥，宿卓薇，张克英*

（四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部重点实验室，四川 成都 611130）

建立一种用于测定鸡蛋粉中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮（5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione，5-VOT）残留量的高效液相色谱法，并探讨5-VOT在鸡蛋中的残留消除情况。选用450 只30 周龄的罗曼粉壳蛋鸡，随机分为3 组，分别饲喂含0%（对照组，处理1）、17.64%（处理2）、29.4%（处理3）菜粕的饲粮，饲喂12 周后各组均换饲对照组的饲粮4 周，实验期共16 周。实验采用乙腈提取鸡蛋粉中5-VOT，样品经超声、离心、旋转蒸干处理，用pH 7.0的磷酸钠缓冲溶液复溶，下层溶液离心后经0.45 μm无机滤膜过滤上机。结果表明，方法平均加标回收率在81.28%～103.28%之间，平均回收率、重复性及精密度的相对标准偏差分别为0.75%～5.17%、2.19%、0.82%，可满足鸡蛋中5-VOT残留量的测定；鸡蛋中5-VOT残留量随着蛋鸡饲粮中菜粕含量以及蛋鸡饲喂菜粕饲粮时间的延长而增加，处理组3菜粨饲喂12 周后5-VOT残留量高达1 837.45 ng/g；换饲对照组饲粮4 周后，鸡蛋中未检出5-VOT。

高效液相色谱法；鸡蛋；5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮

菜粕是十字花科植物油菜籽榨油后的副产物，是重要的蛋白质饲料来源之一［1］，菜粕因其含有丰富的蛋白质和平衡的氨基酸组成［2］，同时含有比豆粕更丰富的矿物元素如钙、磷、铁、锰、锌、铜等［3］，被应用于畜禽饲粮中［4-6］。然而菜粕中含有大量的抗营养因子，主要包括硫葡萄糖苷及其代谢产物，硫葡萄糖苷本身对动物没有毒性［7］，但其代谢产物如噁唑烷硫酮、硫氰酸盐、异硫氰酸酯等会导致动物体肝脏、肾脏、甲状腺等受损伤、抑制动物的生长［8］，限制了其在畜禽饲料中的应用［9］。菜籽中的硫葡萄糖苷种类较多，但最主要有两种，包括3-丁烯基硫葡萄糖苷和2-羟基-3-丁烯基硫葡萄糖苷，前者水解主要产生3-丁烯基异硫氰酸酯，后者水解主要产生5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮（5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione，5-VOT）［10］。5-VOT和硫氰酸盐是造成甲状腺肿大及功能减退的最主要的物质［11］，其中5-VOT造成甲状腺功能减退的活力相当于丙硫氧嘧啶的133%［12］。研究表明，给大鼠腹腔注射1 μg 5-VOT会抑制甲状腺激素的合成，而注射5 μg即会引起甲状腺肿大［13］；长期给大鼠饲喂含50～100 ng/mL 5-VOT的牛奶，同样会引起甲状腺的肿大［14］。当长期给畜禽饲喂含菜粕的饲料时，这些毒素也会蓄积到动物体组织和产品中，如牛奶、肌肉和鸡蛋，对人体健康造成一定的威胁［15］。

欧盟等国家及我国仅对畜禽饲料中噁唑烷硫酮及异硫氰酸酯的含量进行了限量规定，同时也建立了相应的检测方法和标准。国际标准化组织建立的标准方法ISO 5504—1992《油料种子残渣：全部异硫氰酸盐和乙烯基硫代恶唑烷酮含量的测量》是许多国家的官方检测标准，噁唑烷硫酮的测定采用紫外分光光度法，但已于1998年9月17日废除［16］，目前尚未有新标准。我国GB/T 13089—1991《饲料中噁唑烷硫酮的测定方法》［17］和NY/T 1799—2009《菜籽饼粕及其饲料中噁唑烷硫酮的测定：紫外分光光度法》［18］采用紫外分光光度法测定饲料中噁唑烷硫酮，紫外分光光度法相比于高效液相色谱法灵敏度低、检出限高。

有关食品中5-VOT残留量的测定尚无相关标准，仅有极少的研究报道用气相色谱法测定血清、尿液、牛奶中5-VOT含量［19］，用高效液相色谱法测定羊体组织中5-VOT含量［20］，以及分光光度法测定鱼肉中噁唑烷硫酮［21］，而鸡蛋中5-VOT残留量测定方法的研究鲜见报道。

因此，本实验选用高效液相色谱仪，拟建立一种快速、精准、可靠的测定鸡蛋中5-VOT残留量的方法；同时用本方法测定大量鸡蛋样品中5-VOT残留量，探讨5-VOT在鸡蛋中的残留和消除变化情况，为评定鸡蛋的安全食用提供数据支持。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

菜粕（菜籽预压浸提榨油后的副产物） 四川新兴粮油厂；450 只30 周龄的罗曼粉壳蛋鸡 市购。

超纯水（Mini-Q超纯水）、Na3PO4（分析纯）、H3PO4（分析纯） 成都市科龙化工试剂厂；5-VOT标准品（98%，色谱纯） 阿法埃莎（中国）化学有限公司；乙腈、正己烷（均为色谱纯） 美国Sigma公司。

1.2仪器与设备

1200高效液相色谱仪（配备G1314F 1260VWD紫外检测器） 美国Agilent Technologies公司；Heto PowerDry PL6000冻干机 美国Thermo Scientific公司；离心机 美国Eppendorf公司；MX-F漩涡混匀仪漩涡仪美国Scilogex公司。

1.3方法

1.3.1实验分组及鸡蛋样品采集

实验采用单因子完全随机设计，设3 个处理，对照组（不添加菜粕）、60%和100%菜粕组（等氮替代豆粕），即饲粮菜粕水平分别为0%、17.64%、29.4%。参考Leoni等［22］测定饲粮中5-VOT的含量，分别为0、73.99、84.82 μg/g。

选取450 只30 周龄的罗曼粉壳蛋鸡，每个处理10 个重复，每个重复15 只鸡。实验全期为16 周，前12 周分别饲喂各处理饲粮，13 周起各组均饲喂基础组饲粮，饲喂4 周。在实验第4、9、12、16 周结束时，各重复采集2 枚鸡蛋，将蛋黄和蛋清混匀后放于样品袋中，存于-20 ℃条件。鸡蛋冷冻干燥至绝干，粉碎过40 目筛，-20 ℃保存，备用。

1.3.2标准曲线的制作

用分析天平（精度0.01 mg）精确称取3.19 mg 5-VOT至50 mL容量瓶中，加入乙腈定容至50 mL，超声波超30 min（100 W）至标准品溶解，配制成63.8 μg/mL的标准品溶液，储存至4 ℃，以备稀释用。

分别取63.8 μg/mL的5-VOT标准品溶液2 000、1 000、100、10、1 μL于10 mL的容量瓶中，加入色谱纯乙腈定容至10 mL，配制成6.3、63.8、638、6 380、12 760 ng/mL的标准品溶液，240 nm波长色谱条件下检测，记录结果并绘制标准曲线。

1.3.3加标回收率实验

准确称取5-VOT含量为269.06、447.33、602.56、1 487.51 ng/g的鸡蛋粉各3 份，共4 组，在各组鸡蛋样中分别添加0.15、0.20、0.27、0.50 mL质量浓度为6 380 ng/mL的5-VOT标准品溶液，测定5-VOT含量，计算加标回收率。

1.3.4鸡蛋样前处理

用分析天平准确称取19.0 g磷酸钠于1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容至1 000 mL，摇匀，后倒出至烧杯中，用胶头滴管吸取少量磷酸溶液，将磷酸盐溶液的pH值调至7.00，即0.05 mol/L、pH 7.00磷酸钠缓冲溶液。

准确称取鸡蛋粉3.0～5.0 g粉样于50 mL离心管中（精确到0.000 1 g），参考Leoni等［22］的方法，加入15 mL乙腈萃取目标化合物，盖上盖子，漩涡混匀，超声波超声处理15 min，10 000 r/min离心5 min，将上清液倒入鸡心瓶中，重复此操作2 次，用旋转蒸发仪蒸干，后加入2 mL的pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液、2 mL正己烷，超声仪超声1～2 min，保证目标物充分溶解，取下层水溶液至2 mL的离心管中，12 000 r/min离心5 min，下层清液经0.45 μm无机滤膜过滤至2 mL的进样瓶中，储存于4 ℃中备测。

1.3.5色谱条件［13］

色谱柱为安捷伦1200系列C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A相与B相分别为纯水、乙腈（体积比为85∶15，等度洗脱），洗脱溶液为10%异丙醇溶液，柱温30 ℃，波长240 nm，流速1.0 mL/min，时间12 min，进样体积10 μL。

1.4统计分析

数据采用SAS 9.0进行ANOVA分析，以P＜0.05作为差异显著性的判断标准，差异显著者采用LSD法进行多重比较，同时采用GLM程序进行线性回归分析。

2　结果与分析

2.1流动相及洗脱方式的选择

图1　5-VOT标准品（A）和鸡蛋样品（B）色谱图Fig.1　Chromatograms of 5-VOT standard and sample

流动相的选择参照Mabon等［20］的研究在比例上稍作调整，A相为超纯水、B相为乙腈，A相与B相体积以85∶15的比例对样品进行等度洗脱，洗脱时间12 min。结果发现，5-VOT的保留时间为9.141 min，样品经前处理操作后杂质少、对仪器的影响小，目标化合物与其他物质的分离度好，柱效高。标准品和样品色谱图如图1所示。

2.2标准曲线及检出限

按1.3.2节步骤，得出5-VOT的标准曲线。对质量浓度y与峰面积x进行线性回归，得到方程式y=12.183x-39.383（R2=1.000 0），在质量浓度范围6.3～63 800 ng/mL之间线性关系好；以RSN为3计算仪器检出限为0.224 0 ng/mL，以RSN为10计算仪器定量限为0.746 6 ng/mL。

2.3方法回收率

表1　5-VOT加标回收率（n=3）Table1　Recovery rates of 5-VOT in spiked sample （n= 3）

由表1可知，5-VOT检测方法的回收率在81.28%～103.28%之间，回收率的相对标准偏差在0.75%～5.17%之间，可见方法的准确度高。

2.4方法重复性

选择实验第4周处理3的同一个重复鸡蛋样品，准确称取6 份进行检测，结果见表2，5-VOT含量均值为1 014.73 ng/g，相对标准偏差为2.19%，可见方法的可重复性高。

表2　5-VOT检测方法重复性（n=6）Table2　Repeatability of the method （n = 6）

2.5仪器精密度

选择质量浓度为63.8 mg/L的5-VOT标准品上机连续检测6 次，记录峰面积，结果见表3，相对标准偏差为0.82%，可见仪器的精密度高。

表2　5-VOT检测方法重复性（n=6）Table2　Repeatability of the method （n = 6）

2.6样品检测结果

如表4所示，未添加菜粕组鸡蛋中不含有5-VOT。在实验第4、9、12周，随着饲粮中5-VOT含量的增加，鸡蛋中5-VOT残留量极显著增加（P＜0.01），呈一次线性关系（P＜0.000 1）；而随着实验时间的延长，处理组2鸡蛋中5-VOT残留量显著增加（P＜0.05），呈一次线性关系（P＜0.05）；处理组3有显著增加的趋势（P＜0.1），各组在12 周后换饲对照组饲粮4 周后未检出5-VOT。

表4　鸡蛋样检测结果Table4　Results for the determination of 5-VOT in eggs

3　讨 论

菜粕中的抗营养因子硫葡萄糖苷，在葡糖硫苷酶、微生物的水解作用下降解产生很多有毒物质，主要包括5-VOT和硫氰酸盐，对动物的甲状腺组织有很大的毒性，会造成甲状腺的肿大及功能减退。动物采食含菜粕的饲粮后，在肠道微生物的作用下产生5-VOT，其经肠道吸收进入血液后转移至体组织中，对人体健康造成一定的威胁。前人的研究仅是对体液包括牛奶、血浆、尿液［19］以及牛羊肌肉、血浆、肝脏、肾脏、甲状腺［23］中的5-VOT进行了测定，而对鸡蛋中5-VOT含量的测定鲜见报道。可见，测定鸡蛋中5-VOT残留量对鸡蛋的安全食用评定具有很大的意义。

本实验结果表明，采用高效液相色谱法，应用紫外检测器能够满足鸡蛋中5-VOT的测定需求，用乙腈萃取鸡蛋中5-VOT，样品中杂质少，对仪器的影响小，且在12 min内可以将5-VOT与其他化合物完全分离开。标准品质量浓度在6.3～63 800 ng/mL范围之间线性关系好（R2=1.000 0），以RSN=3计算仪器检出限为0.224 ng/mL，平均回收率在81.28%～103.28%之间，平均回收率的相对标准偏差在0.75%～5.17%之间，重复性相对标准偏差为2.19%，精密度相对标准偏差为0.82%。可见，用该法测定鸡蛋中5-VOT残留量结果可靠、准确，能满足鸡蛋中5-VOT残留量的测定需求。

Mabon［23］对牛羊体组织中5-VOT的测定结果，发现不添加菜粕的牛羊体组织中不含有5-VOT，随着日粮中菜粕含量的增加，体组织中的5-VOT的残留量也逐渐增加；同时随着饲喂菜粕日粮时间的延长，各组织中5-VOT的残留量也逐渐的增加；可见，日粮中5-VOT的含量与体组织中该物质的残留量有时间和剂量效应；母羊停饲菜粕1 周后血清中5-VOT被完全清除，而甲状腺中的5-VOT在停饲3 周后完全被清除［24］。本实验的研究结果与其相似，不添加菜粕组的鸡蛋中不含有5-VOT，同时鸡蛋中5-VOT残留量随着蛋鸡饲粮中菜粕含量以及蛋鸡饲喂菜粕时间的延长而增加，具有时间和剂量效应。蛋鸡停饲菜粕4 周后，鸡蛋中未检出有5-VOT残留。

4　结 论

实验采用乙腈提取鸡蛋粉中5-VOT，样品经超声、离心、旋转蒸干处理，用pH 7.0的磷酸钠缓冲溶液复溶，下层溶液离心后上机，方法线性好（R2=1.000 0），回收率在81.28%～103.28%之间，可重复性和精密度高，是一种测定鸡蛋中5-VOT的可靠方法。

鸡蛋5-VOT的含量随着蛋鸡饲粮中菜粕含量以及蛋鸡饲喂菜粕饲粮时间的延长而增加，具有时间和剂量效应；蛋鸡停饲菜粕4 周后，鸡蛋中未检出有5-VOT残留。

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Analysis of 5-Vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione Residue in Eggs by HPLC

ZHU Liping， WANG Jianping， DING Xuemei， ZENG Qiufeng， BAI Shiping， XUAN Yue， SU Zhuowei， ZHANG Keying*
（Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of China， Ministry of Education， Institute of Animal Nutrition，Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）

The study was conducted to establish an analytical method for measuring 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione（5-VOT） residue in eggs and to apply it on eggs from laying hens fed different levels of rapeseed meal （RSM）. A total of 450 30-week-old Lohmann pink-shelled hens were randomly assigned to 3 dietary treatments， including 0%， 17.64% and 29.4% RSM supplementation for 16 weeks （which was withdrawn during the last 4 weeks）. 5-VOT was extracted with acetonitrile，and then evaporated to dryness with a rotating evaporator under vacuum at 35 ℃. The 5-VOT was re-dissolved in 2 mL of phosphate buffer （pH 7.0） and purified with 2 mL of n-hexane. Thereafter， the aqueous solution was transferred to a 2 mL tube and centrifuged for 5 min at 12 000 r/min. The aqueous phase was passed through a 0.45 μm filter for HPLC analysis. The average recovery rates of 5-VOT ranged from 81.28% to 103.28% with relative standard deviations （RSDs） between 0.75% and 5.17%. The RSDs of repeatability and precision were 2.19% and 0.82%， respectively. The further investigation showed that 5-VOT concentrations in eggs linearly increased with the increase in either the level of dietary RSM or feeding time. After 4 weeks of RSM withdrawal， 5-VOT residue was not detected in eggs.

high performance liquid chromatography； egg； 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione

10.7506/spkx1002-6630-201618026

S859.84

A

1002-6630（2016）18-0159-05

朱丽萍， 王建萍， 丁雪梅， 等. 高效液相色谱法测定鸡蛋中5-乙烯基-1，3-噁唑烷-2-硫酮残留量［J］. 食品科学， 2016，37（18）: 159-163. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618026. http://www.spkx.net.cn

ZHU Liping， WANG Jianping， DING Xuemei， et al. Analysis of 5-vinyl-1，3-oxazolidine-2-thione residue in eggs by HPLC［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 159-163. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618026. http://www.spkx.net.cn

2015-10-23

“十二五”国家科技支撑计划项目（2014BAD13B04）；四川省科技厅科技支撑计划项目（2014NZ0043；2014NZ0002）

朱丽萍（1991—），女，博士研究生，研究方向为动物营养与饲料科学。E-mail：357009299@qq.com

张克英（1961—），女，教授，博士，研究方向为家禽营养。E-mail：zkeying@sicau.edu.cn