宋泽玉，徐 伟，牟建迪

(聊城大学生命科学学院，山东聊城 252000)



响应面分析红曲酒酿造工艺研究

宋泽玉，徐 伟，牟建迪

(聊城大学生命科学学院，山东聊城 252000)

[目的]研究红曲酒发酵的工艺参数，对红曲酒的生产给予指导。[方法]选取温度、红曲量、酵母量3个对红曲酒的发酵酒精度影响较大的因素进行单因素试验，考察它们对红曲酒发酵酒精度的影响。在此基础上，设计3因素3水平的响应面分析对红曲酒发酵工艺进行优化。[结果]试验表明，红曲酒的最佳发酵条件为发酵温度29.16 ℃，红曲量34.94 g，酵母量8.07 g，该工艺发酵所得红曲酒酒精的体积分数最高可达15.130 0%。[结论]研究可为红曲酒的工业化生产提供参考依据。

红曲；酵母菌；温度；响应面分析

红曲起源于我国，古时称为丹曲[1]，早在汉朝时期，红曲就被用于酿酒[2]。红曲是以大米为原料，经红曲霉繁殖而成的一种紫红色米曲[3]。红曲中的主要菌是红曲霉[4]，红曲霉是一种耐高温、液化糖化力强又具有药食同源性的菌种[5]。酿酒行业俗称的红曲酶是红曲霉的代谢产物，用它酿造的红曲酒不仅味道醇厚，还具有医疗保健的作用。近年来，随着人们对食品功能的要求越来越高，红曲霉在酿造酒中的应用越来越广泛。

红曲酒主要以糯米为原料，加入酵母菌及红曲米对其进行发酵。目前，已有许多关于红曲酒的研究，但采用响应面分析优化红曲酒发酵条件的研究较少。响应面法可同时对影响生物产量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价[6-7]。响应面法能快速有效地确定多因子系统的最佳条件，并且该法已经广泛应用于各类培养基以及发酵条件的优化[8-9]。针对以上现状，为充分利用红曲的糖化力，减少在红曲酒生产过程中原料的浪费，提高红曲酒生产的经济效益，笔者采用糯米为原料，利用响应面法优化红曲酒发酵的工艺参数，为红曲酒的生产提供参数。

1　材料与方法

1.1材料红曲米，福建省古田县屏湖红酒曲有限公司；酵母菌，安琪酵母股份有限公司；糯米；蔗糖等。主要仪器设备：立式压力蒸汽灭菌锅(BXM-30R)、振荡培养箱(SPX-150B-D)，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超净工作台(SW-CJ-1D型)，苏州净化设备有限公司；电热恒温培养箱(DNP-9082)，上海精宏实验设备有限公司；生化培养箱(SPX-150)，北京市永光明医疗仪器厂。

1.2方法

1.2.1红曲酒酿造的主要工艺流程。锥形瓶(500 mL)内加蔗糖(8.00 g)→加蒸馏水(400 mL)→搅拌均匀→封口→115 ℃灭菌20 min→冷却→加入酵母菌→活化1 h→加入红曲米→加入等量蒸熟的糯米(糯米浸泡24 h后蒸熟，每瓶200 g)→发酵10 d。

1.2.2红曲酒酿造的单因素试验。将糯米与无菌水调成适当的比例进行发酵，pH自然，发酵时间为10 d。分别以发酵温度(22、26、30、34、38 ℃)、红曲米用量(12、24、36、48、60 g)、酵母菌用量(4、8、12、16、20 g)3个因素为考察对象，发酵酒精度为指标，研究各因素对酒精度的影响。

1.2.3红曲酒酿造工艺的响应面优化。根据Box-Behnken中心组合设计原理[10]，在单因素酒精发酵的基础上，以影响酒精度的3个因素：发酵温度(A)、红曲量(B)及酵母量(C)为研究对象，采用3因素3水平的响应面分析，确定最佳参数值[11]。利用响应面分析软件Design-Expert 6.0.5，以发酵终止后发酵液中含有的酒精度为响应值，采用响应面法进行分析讨论[12]。该试验进行3次重复，最终的试验结果取3次试验的平均值。试验的因素和水平表见表1。

表1　响应面试验因素与水平

1.2.4分析测定方法。酒精度测定采用蒸馏-密度法。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果分析

2.1.1发酵温度对酒精度的影响。从图1可以看出，发酵温度在22～30 ℃，红曲酒的酒精度随发酵温度的升高而增加；在30～38 ℃，红曲酒的酒精度随温度的升高而减少。可知发酵温度对菌体生长及代谢有很大的影响，只有在适当的温度下菌体才能进行高效率发酵。在一定温度范围内，菌体的生长代谢速度随温度的升高而增加，酒精积累量也随之增加。在温度超过一定值时，菌体的生长及代谢能力下降，酒精的积累也随之减少。因此，红曲酒发酵的较适温度在30 ℃左右。

图1　发酵温度对酒精度的影响Fig.1　Effects of fermentation temperature on alcoholic strength

2.1.2红曲量对酒精度的影响。由图2可以看出，红曲量在12.0～36.0 g时，酒精度随红曲量的增加而增加；红曲量在36.0～48.0 g时，酒精度随红曲量的增加而减少。可以看出红曲量对酒精度有影响，随红曲量的增加酒精度有先上升后下降的趋势。当红曲达到一定量时，酒精度达到最大值，红曲量继续增加，酒精度逐渐下降。可能是红曲过量时红曲的生长消耗了较多的营养物质，糖分被大量消耗，导致酒精度下降。因此，红曲量的较适量在36.0 g左右。

图2　红曲量对酒精度的影响Fig.2　Effects of red koji quantity on alcoholic strength

2.1.3酵母菌量对酒精度的影响。从图3可以看出，酵母量在4.0～8.0 g时，酒精度随酵母量的增加而增加；在8.0～12.0 g时，酒精度基本没有变化；在12.0～20.0 g时，酒精度随酵母量的增加而减小。酵母量对酒精度的影响较小，随着酵母量的增加酒精度呈先上升后下降的趋势。原因是由于酵母菌接种量较小时，发酵液中酵母浓度低，发酵效率低，产酒精量小；酵母菌接种量较大时，发酵液中的新生酵母细胞比例较小，老细胞比例较大，整体发酵活力低，导致酒精的积累量少。因此，酵母接种量在8.0～12.0 g时产酒精量较多。

图3　酵母量对酒精度的影响Fig.3　Effect of yeast quantity on alcoholic strength

2.2红曲酒发酵响应面优化分析综合单因素试验结果，采用Box-Behnken Design响应面分析法对试验影响因素进行优化。响应面试验设计及结果见表2。

对表2中的试验数据进行多元回归方程拟合，建立红曲酒酒精度(Y)对发酵温度(A)、红曲量(B)、酵母量(C)的拟合方程：Y=-97.120 00+7.531 50A+0.079 500B+0.0971 88C+1.250 00E-003AB-0.010 000AC +7.812 50E-004BC-0.127 40A2-1.650 00E-003B2+4.140 62E-003C2；R2=93.58%，Adj.R2=85.33%。

表2响应面试验设计及结果

Table 2Experimental design and result of response surface methodology

试验号TestNo.因素FactorABC酒精度试验值(Y)Testedvalueofalcoholicstrength∥%酒精度预测值Forecastedvalueofalcoholicstrength∥%100014.8014.522-11011.7011.6131-109.409.494-10113.5012.80500014.5014.5260-1-115.4014.66710110.209.7880-1113.4013.74901-114.6014.261000013.8014.521101113.1013.891211010.009.641310-110.5011.2014-10-112.2012.621500014.5014.5216-1-1011.6011.961700015.0014.52

回归方程中各变量对响应值影响的显著性，由F检验来判断，概率P的值越小，则相应变量的显著性程度越高。方差分析显示：F模型=11.34，P模型=0.002 1**；FA=17.70，PA=0.004 0**；FB=0.036，PB=0.855 4；FC=1.40，PC=0.275 9；FAB=0.11，PAB=0.748 0；FAC=1.14，PAC=0.320 3；FBC=0.11，PBC=0.748 0；FA2=76.36，PA2=<0.000 1**；FB2=3.28，PB2=0.113 1；FC2=0.53，PC2=0.490 8；F失拟=4.97，P失拟=0.077 7。由此看出，当模型F=11.34时，P=0.002 1<0.01，说明模型是极显著的；当失拟项F=4.97时，P=0.077 7>0.05，说明模型失拟项不显著。

通过对立体曲面图分析及偏导数计算得出：A≈-0.20，B≈-0.006 4，C≈-0.98，即发酵温度约为29.16 ℃，红曲量约为34.94 g，酵母量约为8.07 g，响应值Y达到最大，即红曲酒的酒精体积分数达到15.13%。

2.3响应面图与等高线图分析利用Design-Expert 6.0.5软件对回归方程进行分析，做出交互项的三维响应面图及等高线图，能比较直观地解释各个变量和变量之间对响应值的影响[13]。等高线的形状可以反映出交互作用的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[14]。

由图4可以看出，酒精度随温度变化的幅度比较大，曲线坡度比较大，酒精度随红曲量的变化较小，曲线较平滑。由图5可以看出，在温度较低时，酒精度随酵母量的升高有缓慢升高的趋势，在温度较高时，酒精度随酵母量的升高而下降。随酵母量的升高，低温对酒精度的影响逐渐减小，而高温对酒精度的影响逐渐增大。由图6可以看出，红曲量与酵母菌对酒精度的影响有交互作用，随红曲量的增加，酒精度呈先上升后下降的趋势，随酵母量的增加酒精度呈先下降后轻微上升的趋势。在酵母量低时，酒精度普遍高于酵母量高时的酒精度。

图6　红曲量和酵母量对酒精度的影响Fig.6　Effects of red koji quantity and yeast quantity on alcoholic strength

2.4红曲酒发酵优化条件的验证试验由软件自动分析可得红曲酒最佳发酵条件为：发酵温度29.16 ℃、红曲量34.94 g、酵母量8.07 g，所得红曲酒的酒精体积分数预测值为15.130 0%。考虑实际情况，取发酵温度29.00 ℃、红曲量35.00 g、酵母量8.00 g，进行3次平行试验，最终酿得红曲酒的酒精体积分数分别为14.800 0%、14.700 0%、15.100 0%，平均为14.866 7%，与模型预测值基本一致，该模型的建立对红曲酒酒精度的预测比较准确。

2.5红曲酒的质量指标该试验制得的红曲酒的感官指标见表3，理化指标见表4。由表3、4可知，所得红曲酒感官质量达到标准，理化指标符合要求。

表3　红曲酒的感官指标

3　结论

红曲酒是一种以糯米为原料的具有优良保健功能的饮料酒，发酵温度、红曲量、酵母量是对红曲酒的酒精度有较大影响的3个因素。该研究在单因试验的基础上，利用响应面分析法，以酒精度为响应值进行响应面分析设计，建立了发酵温度、红曲量、酵母量3个因素与响应值酒精度之间的数学模型：Y=-97.120 00+7.531 50A+0.079 500B+0.097 188C+1.250 00E-003AB-0.010 000AC +7.812 50E-004BC-0.127 40A2-1.650 00E-003B2+4.140 62E-003C2，F检验模型极显著。对试验因素进行了优化，得到红曲酒的最佳发酵条件为：发酵温度29.16 ℃，红曲量34.94 g，酵母量8.07 g，红曲酒的酒精体积分数预测值为15.130 0%。红曲酒发酵优化条件的验证试验得到红曲酒酒精体积分数平均值为14.866 7%，与模型预测值基本一致。经检验，红曲酒的感官指标、理化指标和微生物指标符合标准。可以较好地为红曲酒生产提供指导。

表4　红曲酒的理化指标

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Research on Brewing Technology of Red Koji Wine by Using Response Surface Analysis

SONG Ze-yu,XU Wei,MOU Jian-di

(College of Life Science,Liaocheng University,Liaocheng,Shandong 252000)

[Objective]To research the technology parameter of red koji wine fermentation,and to give the guidance for the process of red koji wine.[Method]Temperature,red koji quantity and yeast quantity were selected as the factors for single factor test which had relatively great impacts on fermented alcohol content of red koji wine.Effects of these factors on the fermented alcohol content were researched.Based on these,response surface analysis with three factors and three levels were designed to optimize the fermentation technology of red koji wine.[Result]Test showed that the optimal fermentation technology of red koji wine was as follows: 29.16 ℃ fermentation temperature,34.94 g red koji quantity and 8.07 g yeast quantity.Under this technology,the alcoholic content of red koji wine reached 15.130 0%.[Conclusion]This research provides

for the industrialization production of red koji wine.

Red koji;Yeast;Temperature;Response surface analysis

宋泽玉(1995- )，女，山东博山人，本科生，专业：生物工程。

2016-07-08

TS 261.4

A

0517-6611(2016)25-076-03