周　健,余天雾△,吕永双,蒋小卫

(1.重庆医科大学附属永川医院普通外科3病区　402160;2.重庆医科大学附属第二临床学院三腺外科　400010)



论著·基础研究

miR30a体外干预乳腺癌腋窝肿大淋巴结中肿瘤干细胞相关基因表达和侵袭力的变化*

周健1,余天雾1△,吕永双1,蒋小卫2

(1.重庆医科大学附属永川医院普通外科3病区402160;2.重庆医科大学附属第二临床学院三腺外科400010)

目的探讨肿瘤干细胞在乳腺癌患者腋窝肿大淋巴结中微转移灶及微小RNA30a(miR30a)对其侵袭能力的影响，初步探讨miRNAs抗乳腺癌治疗的可行性。方法从乳腺癌患者腋窝肿大淋巴结中分离、培养肿瘤干细胞样乳腺癌细胞。合成 miR30a 寡核苷酸片段，应用腺病毒将该片段转染人原代乳腺癌细胞，同时设乳腺癌MDA-MB-231细胞株为试验对照，每组细胞均设空载体组、空白对照组，以荧光显微镜评估转染效率。以 Transwell 小室体外侵袭试验检测转染前后肿瘤细胞增殖和侵袭力的变化。以Western blot分别检测ALDH1、Vimentin和N-Cadherin蛋白表达。结果Transwell小室体外侵袭试验显示空白对照组中原代乳腺癌细胞较 MDA-MB-231 细胞株侵袭力强，其侵袭指数分别为(75.3±3.2)%，(58.4±2.8)%，两者差异有统计学意义(P<0.05)，而转染miR30a后这两种细胞体外侵袭力均明显减弱，其侵袭指数分别为(21.4±1.9)%,(28.2±2.3)%，与各自空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论乳腺癌患者部分腋窝增生肿大的淋巴结中ALDH表达增高，可能存在肿瘤微转移，术中应完全清扫为宜。miR30a抑制了肿瘤干性基因表达和侵袭能力。

乳腺肿瘤；干细胞；腋窝肿大淋巴结；肿瘤转移；侵袭；miR30a

乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells)可能是乳腺癌术后局部复发和转移的关键因素[1]。对其鉴别主要是基于肿瘤细胞表面的分子表型如CD44+/CD24-/low或乙醛脱氢酶1阳性(aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)[2]。

乳腺癌细胞出现上皮细胞向间质细胞转变(epithelial to mesenchymal transition,EMT) 是上皮细胞获得侵袭、迁移能力的主要方式。因此，研究乳腺癌腋窝淋巴结微转移灶及寻找针对乳腺癌干细胞的有效措施具有重要意义。小RNA干扰可通过各种生物学行为在转录后水平负性调控靶基因的表达，影响多种靶基因的生物学行为，如细胞的生长、凋亡、增殖、分化、转化和衰老[3]。Ouzounova等[4]报道 miR30a 在体内过表达影响乳腺癌的进展，其家族在非黏附的环境中调节乳腺癌细胞的生长。因此，本课题通过检测浸润性乳腺癌患者腋窝增生、肿大淋巴结中乳腺癌干细胞微转移灶，为临床常规清扫腋窝淋巴结微转移灶提供初步依据并探索微小RNA30a(miR30a)干扰对微转移灶中EMT型细胞干性基因的表达和侵袭力的影响，为乳腺癌转移灶的治疗提供一种新的靶点。

1　材料与方法

1.1试剂及材料人白血病抑制因子(hLIF)、人前列腺素源生长因子(h-PDGF)、人表皮细胞生长因子(hEGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF) 和人 B-27 培养基购自美国Protech公司；DMEM/F12、胎牛血清购自德国 Hyclone公司；结晶紫粉购自南京生物试剂公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂、透明质酸酶和Ⅲ型胶原酶购自英国Sigma公司；腺病毒miR30a载体购自上海吉玛制药技术有限公司；MDA-MB-231细胞株获自重庆医科大学附属第二医院中心实验室提供；基质胶(matrix matrigel)、兔抗人CD44-FITC、ALDH1-PE、CD24-PE和鼠抗兔IgG同型对照抗体(FITC)购自美国Santa Cruz公司；兔抗人Vimentin、N-Cadherin、ALDH1多克隆抗体购自美国Ebioscience公司；Transwell小室(孔径8 μm)购自美国Milipore公司；PCR试剂盒购自日本Takara公司成都分公司。

1.2无血清法原代乳腺癌干细胞分离、培养部分参照文献[5]进行。将约1 g大小的肿瘤组织或淋巴结剪碎(约1 mm3)浸入DMEM/F12无血清培养基中，于37 ℃,5% CO2培养箱中消化组织块。过滤，离心5 min(500～1 000 r/min)，收集脱落细胞，共消化4～5 h。收集洗涤后的细胞于DMEM/F12完全培养基培养，24 h后弃去悬浮细胞。待长满皿底时，换以DMEM/F12无血清培养基培养，每1～2天倒置显微镜下观察1次生长状态和融合、成球的情况。待12 d时收集悬浮细胞将其标记为肿瘤干细胞原代(P0)。其铺满皿底将细胞消化传代。同法以无血清培养基培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231。

1.3流式细胞仪鉴定肿瘤细胞表型消化、收集培养的肿瘤细胞(P0)，制作单细胞悬液，按流式抗体说明书以2%的体积分数加入CD44-FITC和CD24-PE抗体(工作液1∶20稀释)并准备同型对照抗体细胞。以流式细胞仪检测CD44、CD24和ALDH1阳性细胞的含量，重复检测2次，取其平均值。

1.4miR30a腺病毒转染乳腺癌细胞将提取的肿大腋窝淋巴结中肿瘤细胞分为3组：试验组1(腺病毒miR30a)、空载体组1和空白对照组1，同时以乳腺癌细胞株MDA-MB-231为对照，转染相应腺病毒后设立试验组2、空白载体组2和空白组2。靶细胞铺板：试验前1 d，向24孔板孔内加入完全培养基(500 μL/孔，靶细胞：5×104个)，于37 ℃，5% CO2培养箱中继续培养过夜。第2天将病毒原液混匀后加入培养板(400 μL/孔)，同时加入polybrene，24 h后弃掉病毒液，换为新鲜完全培养基，7 d后观察并拍照。计算转染率：试验组和空载体组，每组3复孔，每组计数6～8个视野(40倍高倍镜)，取平均值计入公式：转染率(%)=荧光细胞数/细胞总数×100%。

1.5Transwell小室侵袭试验及细胞增殖力检测将Transwell上室内均匀涂一层稀释的基质胶，每组各设3个复孔。向各组Transwell下室加入DMEM完全培养基，向上室内加入细胞悬液，于37 ℃，5% CO2培养12～24 h。以棉签檫去上室基质胶上的细胞后75%乙醇固定，以结晶紫液(2 g/100 mL)染色 15 min后流水冲洗。吹干后倒置显微镜下计数穿膜细胞数并拍照。结果计算：设穿过无Matrigel胶的微孔滤膜细胞数为对照，各试验组穿过Matrigel胶的细胞数与其相比得到相对百分率，以此百分率表示癌细胞体外侵袭指数。MTT法检测肿瘤细胞的增殖指数向24孔板Transwell小室的下室完全培养基中加入MTT溶液(5 mg/mL)150 μL/孔，将小室膜浸没在培养液中，37 ℃培养4 h；离心去上清液后加入二甲基亚砜(DMSO)500 μL/孔，振荡10 min，使结晶物充分溶解后将24孔板置于酶标仪上,设490 nm波长，测吸光度(A)值。

1.6RT-PCR检测转染细胞中miR30a的表达转染筛选后细胞总RNA的提取按Trizol操作说明书并结合文献进行操作。将转染后的细胞加Trizol后，室温放置5 min后离心，弃沉淀，加入氯仿后振荡混匀后室温放置15 min，4 ℃，12 000 r/min离心15 min后取上层水相，加入异丙醇室温放置5 min后，离心10 min，弃上清液，加入75%乙醇温和振荡后离心5 min，弃上清液，真空干燥5 min后加入0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)溶解RNA样品，测A值。

1.7Western blot 法检测肿瘤细胞侵袭分子ALDH1、Vimentin、N-Cadherin的表达细胞为本试验提取培养的人乳腺癌细胞。蛋白提取及蛋白凝胶电泳按照Western blot 说明书操作。培养细胞在80%浓度左右时，以胰酶酶解后裂解，离心收集在试管中，加入450 μL裂解液反复吹打，所得样品用超声细胞破碎仪处理，处理后的样品入水浴箱加热，离心后取上清液。

2　结　　果

2.1乳腺癌干细胞球的生长情况消化、分离乳腺癌患者腋窝肿大淋巴结标本，10例中分离出6例。试验中1例污染，余5例于培养期间均出现部分细胞逐渐凋亡、崩解，部分细胞呈贴壁、增殖和分化状态。3 d时镜下见到细胞呈梭形、尖角状或多角形，逐渐铺满瓶底。换用无血清培养基后仅小部分细胞体积逐渐变大及融合，约12 d后呈较大的单个或多个球状悬浮细胞，折光性强，中心融合且部分发生凋亡。以完全培养基贴壁培养48 h后出现了细胞团，增殖、分裂成新生细胞，形态呈梭形或尖角状，自第2、3代后细胞形态更规则。

2.2流式细胞仪细胞表型鉴定结果经流式细胞仪检测，待测标本中活性细胞占总细胞量的89.50%，其中，ALDH1阳性细胞约占63.95%，CD24-/low约占总细胞数的1.13%，CD44+细胞约占89.78%。流式结果显示在腋窝淋巴结中提取的癌细胞表面的干性基因分子ALDH1和CD44+有较高表达，而CD24-/low呈低表达，这表明经无血清培养法富集的肿瘤细胞具有干性特征。

2.3转染miR30a后细胞增殖能力检测通过MTT法检测转染 miR30a 48 h后从腋窝淋巴结提取的细胞和乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖指数，发现两种细胞与各自空白对照组及空载体组比较，其增殖、生长能力明显受到了抑制，尽管未出现大面积的细胞死亡、崩解，但生长均极其缓慢，于转染后7～10 d才铺满皿底，且细胞间不会完全接触。经MTT法检测，发现试验组1、2细胞增殖能力较各自对应的空载体组1、2和空白对照组1、2明显降低 (P<0.05)，见图1。

A：试验组1；B：试验组2；C：空载体组1；D：空载体组2；E：空白对照组1；F：空白对照组2。a:P<0.05；b:P>0.05。

图1MTT法检测各组细胞增殖能力

2.4检测结果试验结果证实腋窝肿大淋巴结内提取培养的肿瘤细胞具有明显的侵袭和迁徙能力，见图2。空白载体组1、2的侵袭指数分别为(88.6±2.6)%、(63.1±2.0)%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)；而试验组1、2的侵袭指数分别为(21.4±1.9)%、(28.2±2.3)%，两者间差异无统计学意义(P>0.05)，但是分别与空白对照组1(75.3±3.2)%，空白对照组2(58.4±2.8)%相比差异有统计学意义(P<0.05)；而空白对照组1、2和空载体组1、2之间相比差异无统计学意义(P>0.05)。

A：试验组1；B：试验组2；C：空载体组1；D：空载体组2；E：空白对照组1；F：空白对照组2。

图2Transwell 检测肿瘤细胞的侵袭迁徙能力(结晶紫染色×200)

1：空白对照组1；2：空载体组1；3：试验组1；4：空白对照组2；5：空载体组2；6：试验组2。a:P<0.05；b:P>0.05。

图3Western blot检测ALDH1在人原代乳腺癌细胞中的表达

2.5转染 miR30a后肿瘤ALDH1、Vimentin、N-Cadherin的表达变化空白对照组1 ALDH1表达较空白对照组2，差异无统计学意义(P>0.05)，试验组1 ALDH1表达较空载体组1及空白对照组1显著下降(P<0.05)；试验组2 ALDH1表达较空载体组2及空白对照组2显著下降(P<0.05)；且试验组1与试验组2差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。Vimentin(图4)和N-Cadherin(图5)在空白对照组1、2及空载体组1、2的两种细胞中表达量均很高，而空白对照组1较空白对照组2及空载体组1较空载体组2表达更高(P<0.05)。试验组中两种细胞Vimentin和N-Cadherin的蛋白表达量均明显下降，相较而言，试验组1和试验组2较对应的空白对照组及空载体组均要弱很多(P<0.05)。但是试验组中间的表达强弱无明显的差别(P>0.05)。

1：空白对照组1；2：空载体组1；3：试验组1；4：空白对照组2；5：空载体组2；6：试验组2。a:P<0.05；b:P>0.05。

图4Western blot 检测Vimentin在人原代乳腺癌细胞中的表达

1：空白对照组1；2：空载体组1；3：试验组1；4：空白对照组2；5：空载体组2；6：试验组2。a:P<0.05；b:P>0.05。

图5Western blot 检测N-Cadherin在人乳腺癌细胞中的表达

3　讨　　论

有报道称，表达CD44+表面分子、不表达或低表达CD24-分子的乳腺癌细胞具有肿瘤干细胞的特性[6]。而近年来ALDH1是更具鉴定意义的乳腺癌干细胞的标志物[7]；这类细胞能形成乳球细胞、自我更新、侵袭力增强、成瘤和远处转移的潜能[8]。Ginestier等[9]报道ALDH1的肿瘤细胞也可能是乳腺癌远处转移的重要介导子，这类细胞已被认为比CD44+/CD24-更易形成肿瘤，是比CD44+/CD24-更好的预测标志分子。本研究从乳腺癌患者腋窝增生、肿大的淋巴结中提取的细胞经流式细胞仪检测证实其部分细胞的干性标志物CD44+和ALDH1都有较高水平的表达，CD24-呈低表达或不表达，其增殖指数较空白对照组2细胞强，EMT的侵袭分子(Vimentin 和 N-Cadherin)表达上调，表明这类细胞在肿瘤转移中具有重要作用。Tanei等[10]发现ALDH1阳性乳腺癌患者在治疗上完全缓解率显著低于ALDH1阴性的患者。因此，ALDH1是否高表达与乳腺癌的关系极其密切，且与乳腺癌患者疾病的恶性程度和预后相关。

文献报道微小RNAs通过调控干细胞关键调节基因的表达完成干细胞的自我更新和分化[11]，如 miR-203 可以调节EMT标志物分子的表达，如 E-cadherin，CSCs的标志物 CD44+[12]；miR-127的过表达或BCL6的耗竭抑制了乳腺癌细胞的增殖[13]。本研究结果显示miR30a 抑制了乳腺癌原发灶、转移淋巴结和增生肿大的淋巴结中肿瘤干性标志物ALDH1、CD44的表达来抑制肿瘤的进展。对肿瘤侵袭分子EMT的标志分子Vimentin 和N-Cadherin 也显示出了抑制作用。然而miR30a在可疑的乳腺癌腋窝淋巴结转移中异常表达的精确分子机制还有待研究。

[1]Toru H,Susumu I,Hiroaki N.Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential[J].Oncol Rep,2011,25(1):289-296.

[2]Velasco-Velázquez M,Homsi N,Fuente DM,et al.Breast cancer stem cells[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(4):573-577.

[3]Gorospe M,Abdelmohsen K.MicroRegulators come of age in senescence[J].Trends Genet,2011,27(6):233-241.

[4]Ouzounova M,Vuong T,Ancey PB,et al.MicroRNA miR-30 family regulates non-attachment growth of breast cancer cells[J].BMC Genomics,2013,14(1):139.

[5]Walia V,Elble CR.Enrichment for breast cancer cells with stem/progenitor properties by differential adhesion[J].Stem Cells Dev,2010,19(8):1175-1182.

[6]Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):3983-3988.

[7]Charafe-Jauffret E,Ginestier C,Iovino F,et al.Aldehyde dehydrogenase 1-positive cancer stem cells mediate metastasis and poor clinical outcome in inflammatory breast cancer[J].Clin Cancer Res,2010,16(1):45-55.

[8]Charafe-Jauffret E,Ginestier C,Iovino F,et al.Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecularsignature[J].Cancer Res,2009,69(4):1302-1313.

[9]Ginestier C,Hur MH,Charafe-Jauffret E,et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome[J].Cell Stem Cell,2007,1(5):555-567.

[10]Tanei T,Morimoto K,Shimazu K,et al.Association of breast cancer stem cells identified by aldehyde dehydrogenase1 expression with resistance to sequential paclitaxel and epirubicinbased chemotherapy for breast cancers[J].Clin Cancer Res,2009,15(12):4234-4241.

[11]Polytarchou C,Iliopoulos D,Struhl K.An integrated transcriptional regulatory circuit that reinforces the breast cancer stem cell state[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109 (36):14470-14475.

[12]Tian LL,Li MH,Ge JC,et al.miR-203 is downregulated in laryngeal squamous cell carcinoma and can suppress proliferation and induce apoptosis of tumours[J].Tumor Biol,2014,35(6):5953-5963.

[13]Chen JW,Wang M,Guo MZ,et al.miR-127 regulates cell proliferation and senescence by targeting BCL6[J].PLoS One,2013,8(11):e80266.

Intervention in vitro of miR30a on tumor stem cell related gene expression and invasiveness of breast cancer swollen axillary lymph nodes*

ZhouJian1，YuTianwu1△，LvYongshuang1，JiangXiaowei2

(1.ThirdDepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedYongchuanHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China；2.DepartmentofThreeGlandsSurgery,SecondClinicalCollegeofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

ObjectiveTo investigate the micrometastatic lesion of tumor stem cells in the axillary swollen lymph nodes of breast cancer patients and the influence of miR30a on its invasive ability,and to explore the feasibility of miRNAs anti-breast cancer treatment.MethodsThe tumor stem cell-like breast cancer cells were separated from the axillary swollen lymph nodes in breast cancer patients and cultured.miR30a oligonucleotide fragment was synthesized and transfected into human primary generation breast cancer cells by using adenovirus,meanwhile the breast cancer cell line MDA-MB-231 was taken as the experimental control and the transfection efficiency was assessed by the fluorescence microscopy.The changes of tumor cell proliferation and invasiveness before and after transfection were detected by the Transwell chamber in vitro invasion assay.Western blot was used to detect the ALDH1,Vimentin and N-Cadherin protein expression.ResultsThe Transwell chamber in vitro invasion assay showed that the primary generation breast cancer cell had more strong invasive ability than MDA-MB-231 cell line,their invasion indexes were (75.3±3.2)% and (58.4±2.8)% respectively,the difference was statistically significant (P<0.05),and after transfecting miR30a,the in vitro invasiveness ability in these two kinds of cells were significantly weakened and their invasion indexes were (21.4±1.9)% and (28.2±2.3)% respectively,the difference compared with the control group showed the statistical significance (P<0.05).ConclusionThe ALDH expression in partial axillary hyperplasia and swollen lymph nodes in the patients with breast cancer is increased,and the tumor micrometastasis may exist,which should be completely cleaned in operation.miR30a inhibits the expression and invasive ability of tumor stem gene.

breast neoplasms;stem cell;axillary lymph nodes;neoplasms metastasis;invasiveness;miR30a

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.007

重庆市科技计划项目科研基金支持(CSTC2011JJA10038)。作者简介：周健(1986-)，主治医师，硕士，主要从事乳腺肿瘤治疗研究。△

，E-mail:674079699@qq.com。

R73.37

A

1671-8348(2016)12-1605-03

2015-11-18

2015-12-24)