常 亮，郭海龙，党 岩

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉744000）

甘肃东部地区羊口疮病毒PCR检测调查

常 亮，郭海龙，党 岩

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉744000）

本研究以GenBank上羊口疮病毒（ORFV）保守基因B2L序列，设计1对引物并合成，建立了羊口疮病毒PCR检测方法，运用建立的诊断方法对甘肃省东部地区4种养羊模式下羊采血样检测。结果显示，四种类型养羊场采集的羊血样ORFV检测阳性率分别为52.2%、25.8%、59.4%和37.8%，说明本病在甘肃东部地区羊中广泛存在，且感染率很高，也证明建立的PCR方法在羊口疮病毒检测和快速诊断中具有良好的检测效果。

甘肃东部地区；羊口疮病毒；PCR检测

羊口疮，又称羊接触传染性脓疱皮炎或羊传染性脓疱皮炎、羊传染性脓疮，是由羊口疮病毒感染引起的绵羊、山羊接触性、嗜上皮性传染病［1］，以口唇等处的皮肤和粘膜形成丘疹、脓疱、溃疡和结成疣状厚痂为特征，羊群的发病率高达90%，病死率1%-25%［2］，造成了养羊业巨大经济损失。人、犊牛、骆驼等也可感染本病。

本病在甘肃省存在历史已久，分布广泛，从上世纪中叶起就有羊口疮的报道和研究［3］，近几年随着养羊业的发展和饲喂模式的改进，羊口疮在羊呈不断扩展、蔓延之势，亦有多处羊只感染羊口疮病例的临床报道，影响了甘肃省养羊业的健康发展［4］。由于本病与羊感染口蹄疫病毒、羊痘病毒临床症状相似，特别在继发感染或混合感染难以区分，这就为本病的确诊增加了难度。为了准确、快速检测本病，建立了羊口疮病毒PCR检测方法，并对甘肃东部地区4种饲养管理模式下羊口疮病毒的感染情况进行了检测。

1材料与方法

1.1材料

羊口疮病毒、山羊痘病毒毒株，由本实验室保存；临床血样采自甘肃省平凉市崆峒区、庆阳市环县，低温保存。

PCR试剂 （TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP），DNAMarker、琼脂糖等均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成

根据GenBank中ORFV较保守的B2L基因序列，设计引物1对，上游引物为P1：5'-CACGGCCACGAACTTCCACCTCAA-3'，下游引物P2：5'-TCCCGCTCGAAGACCGCAGACAG-3'，预计扩增目的片段大小为540bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成提供。

1.2.2临床血样中DNA的提取

取血样200μL，依次加入00μL灭菌双蒸水、400μL6mol/L的碘化钠、800μL氯仿-异戊醇（24：1），颠倒混匀，14000r/min离心10min；吸上层水相500μL，加入300μL异丙醇，80μL3mol/L醋酸钠，混匀后-20℃静置 10min，14000r/min离心10min；弃上清，加70%乙醇1mL，混匀，14000r/ min离心5min，弃去乙醇，晾干，加20μL灭菌双蒸水4℃保存。

1.2.3PCR扩增及检测

25μL反应体系：10×PCRBuffer（含 Mg2+）2.5μL、dNTP混合物（各2.5mmol/L）3μL、TaqDNA聚合酶 （2.5U/μL）0.2μL、上引物P1、P2（10pmol/ μL）各 1.0μL、DNA模板 2.5μL、灭菌双蒸水（ddH2O）加至25μL。

经优化后PCR条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，最后72℃延伸10min。

取扩增产物8μL与溴酚蓝缓冲液2μL混匀，加样于2%琼脂糖凝胶中，电泳后，观察结果。

1.2.4临床样品的检测

用建立的PCR方法对临床血样进行DNA提取、PCR扩增及检测。

2　结果与分析

2.1PCR结果

从图1看出，用ORFV提取的病毒DNA，经PCR扩增出约540bp的特异性条带，与预期扩增的目的片段大小相一致；健康羊血样DNA未扩增出条带。结果与预期一致，说明建立的该方法可用于羊接触传染性脓疱皮炎病毒的扩增。对照（山羊痘病毒）；3.阳性对照（ORFV病毒煮沸稀释103倍）；4-5.ORFV病毒DNA；6-7.健康羊血样提取DNA后扩增产物

图1　ORFVB2L基因序列PCR扩增

2.2检测图例

从图2看出，临床血样中4号、10号、12号和13号样品扩增出和ORFV病毒大小一致的条带，说明这4份血样中带有羊口疮病毒，证实这四只羊已被羊口疮病毒感染。

图2　血样中羊口疮病毒检测图例

表1　不同饲养管理模式下羊口疮病毒检出情况

2.2检测结果

从表1中可以看出，四种类型养羊模式下羊场采集的羊血样，ORFV检测阳性率分别为52.2%、25.8%、59.4%和37.8%，说明本病在甘肃东部地区广泛存在且感染率很高。

2.3分析

四种类型的羊只养殖模式中，环县的养殖小区ORFV检测阳性率最高，因为养殖小区内小养殖户多，羊群来源混杂、相互传染，加之各养殖户饲喂、管理、疫病防治意识参差不齐且不断有养殖户退出和新养殖户加入，圈舍、料槽、地面等存在消毒不彻底等问题，这也是羊群感染率高原因之一。平凉市崆峒区是西北的牛羊屠宰、加工、销售集散地，崆峒区的养羊场多为异地收羊－－短期育肥-集中屠宰模式，羊群构成复杂、羊只流动频繁，这也是羊群ORFV检测阳性率高原因之一。环县规模化养羊场选址科学、厂区布局合理，羊群的管理、饲喂、配种、免疫、消毒制度健全，羊只发病少，生产效率高。环县个体养羊户羊舍，一般是家庭院舍、旧房改造或近几年新建，相对独立，羊群接触少、相互感染机会小，ORFV检测阳性率相对较低。

实验数据显示和采集血样时养殖户、基层兽医反映，证实近年来羊口疮在羊群中的发病率高。究其原因，主要有以下两个因素：首先，血采集样的甘肃东部养羊业已经实现舍饲化，羊口疮高发期的春、秋季，饲喂的几乎全部为阴干苜蓿或者青贮秸秆，相对放牧时的采食的野干草、灌木松软，羊只发病症状轻或者口唇、舌、鼻等部无明显划伤和结痂，没有引起养殖户注意；其次，羊口疮多发于3-6月龄的羔羊，但病毒会长期携带，故ORFV检测阳性率远高于发病率。

3小结与讨论

羊口疮在所有养羊的国家和地区均有发生，以澳大利亚、新西兰等国最为严重。我国甘肃、新疆、内蒙古、陕西、西藏、四川和云南等省区广泛流行，给养羊业带来巨大经济损失。羊口疮在临床上分为唇型、蹄型和外阴型，以唇型感染为主，其特征为口唇等处皮肤和粘膜形成丘疹、脓疱、溃疡和结成疣状厚痂。羊痘、羊口蹄疫的临床症状与羊口疮极为相似，临床上容易误诊。实验室检测羊口疮的方法较多，如电子显微镜检查、病毒分离、接种试验和AGP等方法［5-7］。琼脂免疫扩散法诊断ORFV，需要3－6周的时间才可出现较高效价的抗体，周期太长；电子显微镜检查羊口疮病毒简单直观，但电子显微镜价位较高、操作复杂，临床应用上受到限制；病毒分离培养也需要较高的要求和较长的时间，因此也不宜进行推广。

本研究选择GenBank上羊口疮病毒（ORFV）保守基因B2L序列，用Primerpremier5.0软件设计1对引物并合成，建立了羊口疮病毒PCR检测方法，结果显示，设计的引物能扩增出的PCR产物为540bp左右，与预期大小一致；本方法检测山羊痘病毒为阴性，检出羊口疮病毒最低量为5pg，具有良好的特异性和敏感性，可用于临床病料检测。经实验证明，本方法检测羊口疮病毒，快速、简单、有准确，且试验条件要求不高，适合于一般的实验室，易于推广。

［1］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.北京：科学出版社，1997.

［2］陈燕军.羊口疮的研究血清学方法的研究［J］.兽医科技杂志，1982（7）：14-19.

［3］李兆甲，沈斌元.肃南裕固族自治县“羊口疮”的调查报告［J］.甘肃农业大学学报，1962（3）：71-75.

［4］王锡祯，王泽华.甘肃省局部地区羊传染性脓疱的发生和防控［J］.中国动物保健，2012（1）：41-42.

［5］庞理化，程庆华，侯秀芬，等.羊口疮病毒组织培养初报［J］.青海畜牧兽医杂志，1982（3）：66-69.

［6］张素珍，张惠安，邝明慧，等.羊口疮病原的分离与鉴定的研究［J］.中国兽医科技，1987（4）：3-4.［6］

［7］何水林，陈杰，蔡玉书，等.羊口疮病毒的分离与鉴定［J］.

中国兽医科技，2002，3（9）：21-23.

S858.26

A

1003-8655（2016）04-0098-02

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（项目编号：GNSW-2013-25）。

∶常亮（1982-），甘肃静宁人，本科，助理研究员，主要从事动物病毒性传染病防治技术的研究工作。