张子扬，程　斐，李若云，胡加明，乐超文，李选奎，洪晨珲，周高峰

醇类对木醋杆菌JMCW-1合成细菌纤维素的影响

张子扬1，程斐2，李若云1，胡加明1，乐超文1，李选奎1，洪晨珲1，周高峰1*

（1.绍兴文理学院生命科学学院，浙江 绍兴 312000；2.浙江塔牌绍兴酒有限公司，浙江 绍兴 312032）

研究了不同醇类对木醋杆菌JMCW-1的影响。结果表明，不同醇类的添加对发酵液的pH影响不大；添加乙醇、丙三醇、乙二醇的发酵液中残糖含量均远远高于空白对照组，添加聚乙二醇的发酵液中残糖含量随添加量的增加先稍稍降低再升高随后又降低，添加聚乙烯醇的发酵液残糖含量随添加量的增加逐渐降低；添加乙二醇的发酵液OD值降低，添加其他5种醇的发酵液OD值升高；添加乙醇、丙三醇和聚乙烯醇可以提高细菌纤维素的产量，乙醇添加量为3.5%时，细菌纤维素的干质量最高，达到22.6 g/L，为未添加时的7倍；甲醇的添加对细菌纤维素的产量无明显影响。添加聚乙二醇、乙二醇对细菌纤维素的产量有一定的抑制作用。

细菌纤维素；醇类；木醋杆菌

细菌纤维素是由产纤维素细菌产生的一种区别于植物纤维素的高分子化合物。与植物纤维素相比，其具有结晶度高、纯度高、聚合度高的特点，并且细菌纤维素具有较高的生物相容性、适应性和良好的生物可降解性。其弹性模量为一般植物纤维的数十倍，且抗张强度高，因此可作为一种新型的生物材料广泛应用于食品生产、造纸、医药等领域［1］。日本已将细菌纤维素应用到了造纸行业中，将细菌纤维素加入纸浆，不仅可提高纸张强度和耐用性，而且解决了废纸回收再利用后纸的纤维强度大为下降的问题。在普通纸浆中加入细菌纤维素可造出高品质用纸（如印制纸币），具有抗水性好、强度高的优点［2-4］。目前细菌纤维素还是一种新型、重要的食品基料和膳食纤维。如传统发酵工艺中，由醋酸菌纯种培养或醋酸菌和其他微生物混合培养，可产生含有丰富纤维素的发酵食品。目前对细菌纤维素的研究主要集中于如何提高细菌纤维素的产量、降低细菌纤维素的成本［5-9］。在黄酒生产过程中会有大量的米浆水被当作废水排出，由于富含糖类等营养物质会导致水体富营养化污染环境［10］。但是米浆水却是产纤维素菌的良好培养基，因此可利用米浆水来生产细菌纤维素，既保护了环境又节约了成本［11］。研究表明醇类对产细菌纤维素的有一定的影响［12-15］。

本研究在发酵培养基中加入不同浓度的6种醇类物质，通过细菌纤维素的产量等指标的测定，来研究醇类物质对所试菌株生长及产细菌纤维素的影响。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

木醋杆菌（Acetobacter xylinus）JMCW-1：本实验室筛选并保藏。

1.1.2培养基

种子培养基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母浸膏0.5%，磷酸氢二钠0.27%，柠檬酸0.115%，硫酸镁0.025%，pH值为5。

发酵培养基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母0.5%，磷酸氢二钠0.5%，柠檬酸0.115%，硫酸镁0.025%，pH值为5。

1.1.3试剂

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、磷酸氢二钠、柠檬酸、硫酸镁、甲醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、聚乙烯醇、聚乙二醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

HWP-16型恒温恒湿培养箱：上海精宏实验设备有限公司；LDZX-40SB1型立式高压蒸汽灭菌锅：致微（厦门）仪器有限公司；DHG-9070AS型电热恒温鼓风干燥器：上海博迅实业有限公司医疗设备公司；UV752型紫外分光光度计：尤尼克（上海）仪器公司。

1.3方法

1.3.1种子液的制备

配制种子培养基，分装到锥形瓶中灭菌。按5%的接种量接入木醋杆菌，190 r/min、30℃摇床培养24 h左右，观察菌的生长状况，取出置于冰箱内备用。

1.3.2醇类添加试验

在发酵培养基中分别加入体积分数1.5%、2.5%、3.5%、4.5%的甲醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、聚乙二醇、聚乙烯醇，得到含醇发酵培养基。

将1.3.1中的种子液按5%的接种量接入含醇发酵培养基中，每组3个平行样品，以普通发酵培养基为对照。在30℃条件下静置培养7 d，测定细菌纤维素膜的干质、培养液pH值、总糖、总酸及菌体浓度。

1.3.3测定方法

纤维素膜产量的测定［3］：挑出纤维素膜。用蒸馏水洗净，用4%的NaOH浸没，80℃条件下浸泡2h。用蒸馏水将纤维素膜洗至pH为7，放进烘箱干燥至质量恒定，计算纤维素产量；发酵液pH的测定：用pH计测定；发酵液菌体浓度的测定［3］：纤维素膜用蒸馏水洗净，加50 mL醋酸钠-醋酸缓冲液，2mL纤维素酶液，放进摇床内振荡，待纤维素膜全部溶解，过滤取滤液，用紫外分光光度计在波长600nm处测其吸光度值OD600nm，即为菌体浓度；发酵液总酸的测定［16］：滴定法；发酵液残糖的测定［16］：亚铁氰化钾法测定。

2　结果与分析

2.1醇类对发酵液pH的影响

由图1可知，添加各种醇类对各发酵液的pH变化影响有一定差异，丙三醇、乙醇对pH呈先下降再上升的趋势，聚乙二醇和聚乙烯醇对pH值呈先上升后波动的趋势，但是各种醇类的不同添加量对发酵液最终pH值影响不大［15］。

图1　醇类添加量对发酵液pH的影响Fig.1 Effect of alcohols addition on the pH in fermentation broth

2.2醇类对发酵液残糖的影响

图2　醇类添加量对发酵液残糖含量的影响Fig.2 Effect of alcohols addition on residual sugar content in fermentation broth

由图2可知，乙醇、丙三醇、乙二醇发酵液中残糖的含量均远远高于空白对照组（添加量为0），可见添加这3种醇类物质后糖被分解利用的量比较少。在聚乙烯醇添加量0～1.5%范围内残糖含量升高，在此阶段聚乙烯醇可能作为能源物质被分解利用；但随着其添加量的增加残糖含量逐渐降低，菌体大量利用培养基中的糖类，不利用聚乙烯醇，从而使培养液中残糖含量降低。在甲醇添加量0～2.5%范围内残糖含量随醇添加量的增加而降低，甲醇添加量继续增加，发酵液的残糖含量也逐渐增加，可能是因为甲醇添加量在0～2.5%范围内由于甲醇含量比较低不能被分解利用，但随着甲醇含量的增加，甲醇逐渐被当作能源物质利用。

2.3醇类对菌体浓度的影响

由图3可知，甲醇、乙醇、丙三醇、聚乙二醇、聚乙烯醇中菌体浓度均高于相应空白对照组。虽然随醇类添加量的增加菌体浓度也有所波动，但总体上菌体含量是高于空白对照组的，可见这5种醇对菌体的繁殖起到促进作用。添加乙二醇的发酵液菌体浓度低于未添加乙二醇的发酵液菌体浓度，且随乙二醇添加量的增加菌体浓度越来越少，可见即使微量的乙二醇也能够抑制产纤维素菌的生长且随添加量的增加抑制作用逐渐增强［16］。

图3　醇类添加量对发酵液菌体浓度的影响Fig.3 Effect of alcohols addition on the biomass concentration in fermentation broth

2.4醇类对发酵液总酸的影响

表1　醇类添加量对发酵液总酸含量的影响Table 1 Effect of alcohols addition on the total acid content in fermentation broth　g/100 mL

由表1可知，添加乙醇的发酵液中总酸含量先增加后降低再增加，在添加量为3.5%时总酸含量最低。在丙三醇添加量为1.5%～2.5%时，发酵液中总酸含量低于空白对照组。聚乙二醇培养液中总酸含量随添加量的增加依次升高并且高于空白对照组。添加甲醇时，总酸含量随甲醇添加量的增加先降低后增加，添加乙二醇、聚乙烯醇时，发酵液中总酸含量随醇添加量的增加先增加后降低。

2.5醇类对细菌纤维素产量的影响

图4　醇类对细菌纤维素产量的影响Fig.4 Effect of alcohols on bacterial cellulose production

由图4可知，添加乙醇可以明显提高细菌纤维素的产量，添加3.5%的乙醇，细菌纤维素产量最高，达到22.6 g/L，为未添加时的7倍；继续增加乙醇添加量，细菌纤维素产量变化不明显。添加甲醇时细菌纤维素的产量无明显影响。添加聚乙二醇、乙二醇对细菌纤维素的产量有一定的抑制作用，抑制作用随着聚乙二醇添加量的增加而加强，乙二醇在2.5%～3.5%抑制趋势虽有所减弱但总体处于抑制状态。添加丙三醇和聚乙烯醇，细菌纤维素的产量有一定提高，细菌纤维素产量随着丙三醇添加量增加而增加；聚乙烯醇添加量为2.5%时达到最高，而后稍有降低。

3　结论

乙醇、丙三醇能够促进纤维素菌的生长繁殖，提高细菌纤维素的产量，并且在其添加量为3.5%时细菌纤维素的产量也最高；乙二醇和聚乙二醇对产细菌纤维素微生物的生长具有一定的抑制作用；适宜浓度的甲醇、聚乙烯醇能提高细菌纤维素的产量。

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Effects of alcohols on the production of bacterial cellulose byAcetobacter xylinusJMCW-1

ZHANG Ziyang1，CHENG Fei2，LI Ruoyun1，HU Jiaming1，LE Chaowen1，LI Xuankui1，HONG Chenhui1，ZHOU Gaofeng1*
（1.College of Life Science，Shaoxing University，Shaoxing 312000，China；2.Zhejiang Pagoda Brand Shaoxing Rice Wine Co.，Ltd.，Shaoxing 312032，China）

The effect of different alcohols onAcetobacter xylinusJMCW-1 was studied.The results showed that different alcohols addition had little effect on the pH of fermentation broth.Residual sugar levels in the broth added ethanol，glycerol，ethylene glycol were much higher than that in control group.Residual sugar levels in the broth added polyethylene glycol first lowered and then increased slightly and subsequently reduced.Residual sugar levels in the broth added polyvinyl alcohol gradually decreased.The OD in the broth added glycol decreased，and the OD in the broth added other alcohols increased.Ethanol，glycerol，and polyvinyl alcohol can increase the yield of bacterial cellulose；the dry weight of bacterial cellulose reached the highest 22.6 g/L with ethanol addition 3.5%，which was seven times of the blank group.Methanol had no significant effect on bacterial cellulose production.Polyethylene glycol and ethylene glycol had a certain inhibition on bacterial cellulose production.

bacterial cellulose；alcohols；Acetobacter xylinus

Q939.97

0254-5071（2016）07-0099-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.021

2016-03-21

绍兴文理学院校级科研项目（2013LG1007）

张子扬（1993-），男，本科生，研究方向为微生物发酵培养基优化。

周高峰（1986-），男，助教，硕士，研究方向为微生物发酵原理。