杨　阳，刘　蕊，王英明，张玉丹，李　岩，陈宝瑾，任　航

（1.新疆红帆生物科技有限公司，新疆 库尔勒 841100；2.中国专利技术开发公司，北京 100088；3.上海市浦东新区浦南医院，上海 200125；4.哈尔滨市食品药品检验检测中心，黑龙江 哈尔滨 150025）

番茄红素提纯工艺条件的研究

杨阳1，刘蕊1，王英明1，张玉丹1，李岩2，陈宝瑾3，任航4

（1.新疆红帆生物科技有限公司，新疆 库尔勒 841100；2.中国专利技术开发公司，北京 100088；3.上海市浦东新区浦南医院，上海 200125；4.哈尔滨市食品药品检验检测中心，黑龙江 哈尔滨 150025）

以番茄红素油树脂为原料，利用皂化法和重结晶法作为主要提纯工艺，纯化得出高含量的番茄红素晶体。通过单因素及正交试验，确定番茄红素提纯工艺的最佳提取条件为番茄红素油树脂∶丙三醇∶氢氧化钾∶无水乙醇比例4∶3∶1∶1（V/V），皂化温度70℃，皂化时间2.5 h，重结晶时间48 h，在此条件下番茄红素纯度达到61.64%。

番茄红素油树脂；皂化法；重结晶法；提纯工艺

番茄红素（lycopene）的分子式为C40H56，分子质量为536.88，属于异戊二烯类化合物，是一种脂溶性色素，它被认为是目前市场最具商业价值及健康价值的保健产品之一，并且番茄红素是天然产物中很少能够独立起作用的化学物质［1-3］。最近这些年，关于天然提取物与患病率之间作用的研究已非常受关注［4-5］。天然提取物作为功能性食品或药物的成分，与其他各种化学物质的相互作用成为调节人体生物机能的重要过程［6-7］。番茄红素的提取方法主要有化学合成法、微生物发酵法及超临界二氧化碳提取法等［8-9］。由于目前番茄红素标准品售价相当高，所以怎样将得到的番茄红素油树脂提纯得到纯度更高的番茄红素是值得研究的一个课题［10］。本试验首先利用氢氧化钾对番茄红素油树脂进行皂化反应，除去油树脂中的游离脂肪酸及大部分脂肪酸甘油酯，再加入有机溶剂对粗提物进行初步提取，然后进行第二次皂化反应，形成水溶性皂化物，最后用重结晶法得到纯度较高的番茄红素晶体［11-14］。本方法操作相对简便，成本较低，并且还不需要贵重复杂的仪器，可为番茄红素纯品的工业化生产提供理论依据［15］。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

3%番茄红素油树脂（超临界CO2方法萃取得到）：新疆红帆生物科技有限公司。

氢氧化钾、无水乙醇、丙三醇、乙酸乙酯、盐酸均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

B-260恒温水浴锅：北京泰克仪器有限公司；DZF-6090真空干燥箱：上海雷韵试验仪器制造有限公司；722s紫外可见光分光光度计：北京泰克仪器有限公司；BCD-248WBJV冰箱：海尔集团。

1.3方法

1.3.1番茄红素油树脂的皂化

将番茄红素油树脂、丙三醇、氢氧化钾及无水乙醇按照一定的皂化比例，在一定皂化时间及温度条件下进行皂化反应，经充分反应后加蒸馏水混匀，静置分层，然后用分液漏斗萃取分离，过滤得到的番茄红素晶体用弱盐酸进行中和，并用大量的蒸馏水冲洗至中性，真空干燥得到皂化后的番茄红素产品。

1.3.2番茄红素油树脂的重结晶纯化

以乙酸乙酯为重结晶溶剂，称取适量皂化后的番茄红素油树脂，溶于70℃的乙酸乙酯中溶解达到饱和，滤去不溶物，再在水浴中匀速降温至晶体大量析出，采用在0℃条件下对番茄红素进行纯化，纯化后的番茄红素在4℃条件下避光保存。

1.3.3单因素试验

皂化比例（体积比）的确定：番茄红素油树脂、丙三醇、氢氧化钾及无水乙醇按照2∶2∶1∶1、3∶2∶1∶1、3∶3∶1∶1、4∶3∶1∶1、4∶4∶1∶1的比例，在温度为70℃水浴条件下皂化反应1 h，皂化反应结束后进行重结晶，重结晶时间为24 h，然后测定提纯后的番茄红素纯度。

皂化温度的确定：将番茄红素油树脂、丙三醇、氢氧化钾及无水乙醇按照4∶3∶1∶1的比例分别在温度为55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴条件下皂化反应1 h，皂化反应结束后进行重结晶，重结晶时间为24 h，然后测定提纯后的番茄红素纯度。

皂化时间的确定：将番茄红素油树脂、丙三醇、氢氧化钾及无水乙醇按照4∶3∶1∶1的比例，在温度为70℃水浴条件下分别进行皂化反应1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，皂化反应结束后进行重结晶，重结晶时间为24 h，然后测定提纯后的番茄红素纯度。

重结晶时间的确定：将番茄红素油树脂、丙三醇、氢氧化钾及无水乙醇按照4∶3∶1∶1的比例，在温度为70℃水浴条件下皂化反应1 h，皂化反应结束后进行重结晶，重结晶时间分别为12 h、18 h、24 h、36 h、48 h，然后测定提纯后的番茄红素纯度。

1.3.4正交试验

在单因素试验的基础上，以皂化比例、皂化温度、皂化时间和重结晶时间为4个影响因素，番茄红素纯度为考察指标，进行L9（43）正交试验。正交试验因素与水平见表1。

表1　番茄红素提纯工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for lycopene purification technology optimization

1.3.5测定方法

准确称50mg左右的样品于100mL容量瓶中，加入2 mL二氯甲烷使样品充分溶解，然后加入石油醚中分散定容，过滤后取滤液在波长502 nm处测定其吸光度值A。番茄红素的纯度计算公式：

式中：C为番茄红素的纯度，%；A为滤液吸光度值；N为稀释倍数；W为样品质量，g；3078为1%番茄红素在含2%二氯甲烷的正己烷中的消光系数。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1皂化比例对番茄红素提纯工艺的影响

表2　皂化比例对番茄红素提纯工艺的影响Table 2 Effect of saponification ratio on the purification technology of lycopene

从表2可知，当皂化比例为2∶2∶1∶1（V/V）时，番茄红素纯度最低，仅为29.25%，提纯效果最差；当皂化比例为4∶3∶1∶1（V/V）时番茄红素纯度最高，达到55.97%，提纯效果最好。发现随着皂化比例的增加，番茄红素提纯浓度增加，当皂化比例超过4∶3∶1∶1（V/V）时，番茄红素纯度反而下降，原因可能是皂化作用可以除去原料中的一些杂质，有利于溶剂提取番茄红素，但番茄红素对碱不稳定，碱性过强容易发生氧化而损耗，因此，碱的比例增加反而浓度会下降。因此，选择最佳皂化比例为4∶3∶1∶1（V/V）。

2.1.2皂化温度对番茄红素提纯工艺的影响

表3　皂化温度对番茄红素提纯工艺的影响Table 3 Effect of saponification temperature on the purification technology of lycopene

从表3可知，当皂化温度为55℃时，番茄红素纯度最低，仅为30.78%，提纯效果最差；当皂化温度为70℃时，番茄红素纯度最高，达到58.77%，提纯效果最好。温度＞70℃以后，提纯效果下降，原因可能是由于番茄红素对热很不稳定，在温度较高时会发生氧化降解反应及顺反异构，从而造成番茄红素提纯浓度的下降。因此，选择最佳皂化温度为70℃。

2.1.3皂化时间对番茄红素提纯工艺的影响

表4　皂化时间对番茄红素提纯工艺的影响Table 4 Effect of saponification time on the purification technology of lycopene

从表4可知，当皂化时间为1 h时，番茄红素纯度最低，仅为45.78%，提纯效果最差；当皂化时间为2.0 h时，番茄红素纯度最高，达到59.63%，提纯效果最好。皂化时间＞2.0 h之后，提纯效果下降，原因可能是由于随着时间的延长，原料温度快速上升，使得番茄红素发生氧化降解反应及顺反异构，从而造成番茄红素提纯浓度的下降。因此，选择最佳皂化时间为2.0 h。

2.1.4重结晶时间对番茄红素提纯工艺的影响

表5　重结晶时间对番茄红素提纯工艺的影响Table 5 Effect of recrystallization time on the purification technology of lycopene

从表5可知，当重结晶时间为12 h时，番茄红素纯度最低，仅为46.66%，提纯效果最差；当重结晶时间为36 h时，番茄红素纯度最高，达到60.07%，提纯效果最好。理论上，重结晶时间越长，番茄红素提纯浓度自然也越高，但由于番茄红素的稳定性比较差，随着重结晶时间的延长，番茄红素也在逐渐氧化降解和异构化，那么纯度就必然会降低。从晶体刚出现时到重结晶时间为36 h时番茄红素晶体的颜色逐渐加深，但是当重结晶时间达到48 h时，晶体的颜色变浅，其原因可能与番茄红素的氧化分解和异构化有关。因此，选择最佳重结晶时间为36 h。

2.2正交试验

表6　番茄红素提纯工艺优化L9（34）正交试验结果与分析Table 6 Results and analysis of L9（34）orthogonal experiments for lycopene purification technology optimization

根据表6的正交试验结果可见，本试验研究的4个因素对番茄红素的提纯效果均有影响，其影响程度顺序为皂化比例＞皂化温度＞重结晶时间＞皂化时间。通过极差分析可知，最佳工艺组合为A2B2C3D3，即皂化比例为4∶3∶1∶1（V/V），皂化温度为70℃，皂化时间为2.5 h，重结晶时间为48h。在此条件下进行验证试验，番茄红素的纯度为61.64%。

3　结论

以3%番茄红素油树脂为原料，研究了皂化比例、皂化温度、皂化时间、重结晶时间对番茄红素提纯工艺的影响。结果表明，4个因素对番茄红素纯度影响的显著程度依次为皂化比例＞皂化温度＞重结晶时间＞皂化时间。最佳的提纯工艺条件为皂化比例为4∶3∶1∶1（V/V）、皂化温度为70℃、皂化时间为2.5 h、重结晶时间为48 h时，在此条件下，番茄红素纯度可达61.64%。

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Research of purification technology of lycopene

YANG Yang1，LIU Rui1，WANG Yingming1，ZHANG Yudan1，LI Yan2，CHEN Baojin3，REN Hang4
（1.Xinjiang Tomato Red Co.，Ltd.，of Biological Science and Technology，Korla 841100，China；2.China Patent Technology Development Corporation，Beijing 100088，China；3.Shanghai Punan Hospital of Pudong New District，Shanghai 200125，China；4.Harbin Food and Drug Inspection Center，Haerbin 150025，China）

Using the lycopene oleoresin as raw material，the lycopene crystal with high content was obtained by saponification and recrystallization method which were the main purification technology.By single factor and orthogonal experiments，the optimum extraction conditions of lycopene were determined as lycopene oleoresin：glycerol：potassium hydroxide：absolute ethyl alcohol ratio 4∶3∶1∶1（V/V），saponification temperature 70℃，saponification time 2.5 h and recrystallization time 48 h.Under the conditions，the purity of lycopene was up to 61.64%.

lycopene oleorisine；saponification method；recrystallization method；purification technology

TS264.2

0254-5071（2016）03-0111-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.025

2016-01-18

杨阳（1987-），男，助理工程师，硕士，主要从事保健品开发利用的工作。