黄　倩，叶聪莹，刘小川,b

(浙江理工大学，a.生命科学学院；b.生物工程研究所，杭州 310018)



薏苡胚油脂分子标记鉴定及遗传多样性分析

黄倩a，叶聪莹a，刘小川a,b

(浙江理工大学，a.生命科学学院；b.生物工程研究所，杭州 310018)

薏苡被誉为“世界禾本科之王”。它作为药食两用植物，特别以薏苡中性油脂为主要有效成分，用于辅助抗癌的药物，已在美FDA获准Ⅲ期临床。利用34个多态性丰富的RAPD分子标记，分析了23份不同地理来源的薏苡种质的遗传多样性，结果获得405个多态性片段，通过UPGMA聚类分析法，23份供试薏苡资源被分为5种类型，分类结果与地理来源和种质系谱一致。薏苡胚油脂分子标记鉴定中，胚油脂含量检测发现23份种质平均值仅为3.47%，但LG013中却高达8.99%，同时，发现长度约为1050 bp的片段为LG013的特有条带。经克隆和特异引物的鉴定，结果显示在600 bp处LG013拥有特异性代表条带，可作为该品种鉴定和知识产权保护的重要依据。

薏苡；胚油脂；分子标记；RAPD；遗传多样性

0　引　言

薏苡(Coixlacryma-jobiL.)别名水玉米(东北)，草珠子(山东)，晚念珠(福建)等[1]，为一年生或多年生C4草本植物[2]。作为世界上最受青睐的药、食同源植物之一，薏苡被誉为 “世界禾本科之王”，欧洲人甚至将薏苡视为“生命健康之禾”。它的营养价值很高，薏苡中含有丰富的蛋白质，含量约为14.26%；脂肪含量约为5.56%，所含的脂肪中，多为油酸、亚油酸这些对人体有益的不饱和脂肪酸；纤维含量约为0.44%；同时含有锌、钠、铁、钙、镁、铜、锰、锶等8种微量元素，锌含量为43.24 μg/g，钠含量为118.64 μg/g，铁含量为212.90 μg/g，钙含量为749.00 μg/g，镁含量为1193.60 μg/g，铜含量为11.70 μg/g，锰含量为36.06 μg/g，锶含量为0.64 μg/g；薏苡仁中含有约为0.2%的中性油脂，中性油脂证实具有抗癌功效[3-4]。

薏苡具有很高的药用价值，它作为药材，在很早以前就已被我们的祖先广泛使用，我国就将薏苡作为治疗肥胖[5]、肠炎[6]、小儿厌食症[7]、风湿性关节炎[8]、湿疹、扁平疣、坐骨神经痛、传染性软疣、尖锐湿疣、慢性阑尾炎等疾病的药物[5-11]。在薏苡众多的药用价值中，最引人注目的是薏苡仁中性油脂防、治癌症[9-10]这一药用价值。早在1961年之际，当时的研究工作者就从薏苡中提出来了薏苡仁酯，即薏苡仁中性油脂，后发现薏苡仁中性油脂有抑制癌细胞增殖和扩散[11]，促进癌细胞凋亡[12]的功效。这个已经在人喉癌细胞Hep-2细胞凋亡实验[13]和人鼻咽癌细胞凋亡[14]实研究中得到了证实。

2015年，以薏苡中性油脂为主要成分的“康莱特注射液”特效抗癌药，首次通过美国FDA认证，进入Ⅲ期临床阶段，是目前唯一一个在美国得到FDA认可的中草药。目前薏苡胚油脂含量检测异常困难，NCBI数据库也缺乏薏苡这一小物种基因序列信息，国内没有人做薏苡胚油脂相关方面工作。本研究主要目的，是通过RAPD分子标记分析所收集的23种(LG001～LG023)薏苡种质的遗传多样性，并尝试对薏苡胚油脂性状进行分子标记鉴定，为薏苡油脂含量种质资源改良及分子育种研究奠定基础。

1　实验部分

1.1材料

供试材料为23份不同地理来源的薏苡种质材料，由浙江理工大学生命科学学院生物工程研究所收集(表1)。

表1　供试薏苡的编号及粒色

1.2方法

1.2.1薏苡胚油脂含量的计算

根据胚压前质量、胚压后质量、种粒重可计算得到23份薏苡胚油脂含量I：

胚油脂含量I=

(1)

其中：胚压前质量(g)测量是以小刀轻柔刮取薏苡胚(尽量刮干净)后称重；胚压后质量(g)测量是用力挤压两块透明板(中间垫有3层滤纸，薏苡胚置上)后，种粒重(g)测量直接称重得出。

1.2.2DNA的提取

各供试材料取30粒，经45 d萌发、成小苗至10 cm左右，各称取2.0 g鲜嫩的薏苡叶片用液氮研磨，采用改良的CTAB法[15]提取DNA。用65℃提前预热的CTAB液裂解细胞(NaCl使用浓度700 mM)，氯仿异戊醇抽提(取上清)，经RNA酶消化，-20℃预冷异丙醇沉淀DNA(放冰上沉淀20 min)，70%乙醇洗涤后，用ddH2O溶解。所有DNA样本经Nano Drop2000测定浓度，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测基因组质量合格后，用ddH2O稀释到10 ng/μL，-20 ℃保存、备用。

1.2.3RAPD扩增、电泳及EB染色

RAPD引物：薏苡作为小作物，在NCBI数据库中没有薏苡基因组的任何信息[16]，从玉米、小麦、水稻等(薏苡与它们亲缘关系近，同为禾本科)近源种的256个RAPD引物中共筛选出34个扩增条带清晰、稳定的RAPD引物，由上海生工合成(表2)。

表2　RAPD引物序列信息

PCR反应体系：使用BIO-RAD S1000TMThermal扩增仪，10 μL反应体系：30 ng DNA模板，1.0 μL 10×Taq Buffer(Takara，Dalian，China)，0.8 μL dNTP 2.5 mM(Takara，Dalian，China)，0.4 μL Mg2+25 mM(Takara，Dalian，China)，0.1 μL RAPD primer 20 uM(Sangon，Shanghai，China)，0.1 μL rTaq enzyme 5 U/μL(Takara，Dalian，China)，补ddH2O至10 μL。PCR反应程序：(94℃，3 min)预变性，[(94℃，30 s)变性；(t℃，45 s)退火，具体t℃参考表2，RAPD引物TM值；(72℃，2 min)延伸]34个循环，继续延伸(72℃，10 min)，4℃，保存。电泳及EB染色：经1.5%琼脂糖凝胶电泳，15 min EB染色、漂洗后，紫外灯下观察实验结果并保存图片，记录相关信息。

1.2.4RAPD聚类分析

RAPD聚类分析是以23份供试薏苡RAPD标记结果图为依据，统计结果图中所有扩增条带，并以此建立Microsoft Excel数据库，若有条带记为1，没有条带则记为0。按UPGMA聚类分析法，Ntedit录入数据，NTSYS-pc2.10e聚类分析软件分析数据，获得系统聚类图。

1.2.5克隆、引物设计及鉴定

克隆：将重组载体(1050 bp目的片段DNA/载体PMD-18T)导入大肠杆菌DH5a感受态细胞中表达；在LB固体板(含100 μg/ml Amp)上挑选阳性单克隆菌落；经菌液PCR(M13+/M13-引物)检测合格后，送上海生工测序。根据测序结果，使用Primer5.0软件，设计引物F：TCTGGTGAGG GGAGTCACA，R：TCTGGTGAGGCATGGTGT。采用TD PCR程序对薏苡胚油脂含量标记进行鉴定。

2　结果与分析

2.1薏苡胚油脂含量分析

薏苡胚油脂含量的检测常使用HPLC法、紫外光谱法、层析法，这些方法虽有效但操作起来非常复杂，目前仍缺乏便捷、有效的检测薏苡胚油脂含量的手段。利用物理压榨法(1.2.1)，通过公式(1)计算可得到23份供试薏苡胚油脂含量百分比(%)具简单、有效的特点。表3可知，23份供试薏苡资源的胚油脂含量在1.728%～8.994%之间，LG013是这23份供试薏苡中胚油脂含量最高的品种，高达8.994%，23个种质资源的平均值仅为3.47%。其中，LG013、LG010、LG001、LG023、LG005、LG015、LG007、LG017、LG006这9个供试薏苡资源胚油脂含量明显高于平均值3.47%，可能与薏苡种质、地理来源有关。23份供试薏苡的胚油脂含量的检测结果为薏苡胚油脂含量种质资源的相关研究，寻找优良的薏苡种质品种奠定基础。

表3　供试薏苡胚油脂含量百分比

2.2RAPD标记分析

薏苡作为小作物，在NCBI数据库中没有薏苡基因组的任何信息，从玉米、小麦、水稻等(薏苡与它们亲缘关系近，同为禾本科)近源种的256个RAPD引物中共筛选出34个扩增条带清晰、稳定的RAPD引物进行RAPD分析。利用34个多态性丰富的RAPD分子标记，结果共获得405个多态性片段，平均每个RAPD分子标记扩增得到11个多态性片段。其中，在S44引物的体外扩增结果中，如图1所示，发现第400个多态性片段，分子量约为1050 bp，LG013(23个供试薏苡胚油脂含量最高，达8.99%)在此处有特异条带，其它22份薏苡此处均没有任何条带。使用割胶回收试剂盒Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Cat#9762)将此带割胶回收，并克隆、测序，根据测序结果设计引物F：TCTGGTGAGGGGAGTCACA，R：TCTGGTGAGGCATGGTGT用来作为鉴定薏苡胚油脂性状分子标记。

图1　S44引物对23份供试薏苡标记结果

2.3种质间聚类分析

RAPD标记聚类结果图中，RAPD遗传相似系数，其变幅为0.55～0.96。其中LG019/LG020薏苡品种的相似系数最高，达到0.96。采用UPGMA(Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Means)聚类分析法，以0.75遗传相似系数为标准将23种供试薏苡资源划分为5大类(表4)：第I类包括LG012(黄白色)、LG004(棕色)；第II类包括LG013(黄白色)、LG015(黑褐色)、LG023(黄白色)、LG007(黑褐色)、LG009(黄白色)、LG014(黄白色)、LG002(黄白色)、LG022(黄白色)、LG005(黑褐色)、LG003(黄白色)、LG016(深棕色)、LG011(深棕色)；第III类包括LG021(棕色)、LG008(灰色)；第Ⅳ类包括LG017(黄白色)、LG018(黑褐色)、LG001(深棕色)；第Ⅴ类包括LG019(黄白色)、LG020(棕色)、LG006(深棕色)、LG010(黄白色)。LG013是23种薏苡胚油脂含量最高的品种，高达8.99%，属于第II类。从图2和表4可看出，第Ⅰ类和第Ⅳ类遗传距离较近，第Ⅱ类和Ⅴ类遗传距离较近，第Ⅲ类遗传距离呈现多样化，这一分类结果与种质系谱和地理来源一致。(图2、表4)

图2　RAPD标记聚类结果

类群编号种质ILG012、LG004ⅡLG013、LG015、LG023、LG007、LG009、LG014、LG002、LG022、LG005、LG003、LG016、LG011ⅢLG021、LG008ⅣLG017、LG018、LG001ⅤLG019、LG020、LG006、LG010

2.4分子标记鉴定结果分析

利用上下游引物F/R(F：TCTGGTGAGG GGAGTCACA，R：TCTGGTGAGGCATGGTG)，使用Touchdown PCR对薏苡胚油脂含量性状的分子标记进行鉴定，结果表明LG013有600 bp特异性条带，其它22份薏苡此处均没有条带(图3)。这可能与胚油脂含量密切相关，并可作为该品种特异性条带， F/R可用于该品种鉴定、专利申请和高含量胚油脂性状的分子鉴定。

图3　F/R引物鉴定23份供试薏苡结果

3　结　论

本研究利用34个RAPD引物，对23份供试薏苡种质进行遗传多样性分析，采用UPGMA聚类分析法，以0.75遗传相似系数为标准将23种供试薏苡资源划分为5大类，这个结果与23份薏苡地理来源、种质系谱相一致，为薏苡种质资源相关研究奠定基础。LG013胚油脂含量高达8.99%，为23份供试薏苡胚油脂含量最高的品种(平均值仅为3.47%)且分子鉴定结果表明LG013有600 bp特异性条带，可用于该品种鉴定、专利申请和高含量胚油脂性状的分子鉴定。相关薏苡胚油脂性状的分子鉴定仍需要F2代薏苡群体的进一步鉴定，才能真正确定F/R引物作为相关薏苡胚油脂性状的分子鉴定。

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(责任编辑： 许惠儿)

Identification of Embryo Oil Molecular Marker and Genetic Diversity Analysis of Coix

HUANGQiana，YECongyinga，LIUXiaochuana,b

(a. Institute of Bioengineering; b.College of life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China)

Job’s-tears, which are the honored as the “king of grass family of the world”, can be used as medical and edible plants. Especially, the neutral grease, major effective component in coix, can be used as auxiliary anticancer medicine and has been approved for phase-III clinic by FDA of America. Here, this paper analyzed the genetic diversity of 23 coix germplasms from varied geographic sources by using 34 RAPD molecular markers with rich polymorphism and obtained 405 polymorphic segments; according to the UPGMA clustering methodology, 23 coix sources for experiment were divided into 5 categories and the classification result was consistent with the geographic sources and germplasm genealogy. According to the identification the coix embryo grease molecular marker, it is found in the detection of embryo grease content that the average of 23 germplasms is merely 3.47% but the embryo grease content in LG013 reaches up to 8.99%; meanwhile, the fragment with a length of about 1050 bp is the excusive strip of LG013. After identification of clone and specific primer, the result shows that LG013 has a specific representative strip in 600 bp and this can be used as an important basis for the variety identification and intellectual property protection.

coix; embryo grease; molecular marker ; RAPD; genetic diversity

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.05.023

2015-12-07

黄倩(1990-)，女，湖北武汉，硕士研究生，主要从事分子遗传育种方面的研究。

刘小川，E-mail: xcliu@zstu.edu.cn

Q321

A

1673- 3851 (2016) 03- 0458- 05 引用页码： 050705