王吉明，尚建立，李 娜，马双武，徐永阳

（中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009）

DNA是遗传物质的重要信息载体，DNA提取的数量及质量与PCR扩增、限制性酶切、Southern杂交、测序等分子生物学研究密切相关[1]。在西瓜研究中通常从真叶中提取DNA[2-4]，以满足SSR、SRAP等分子标记的需求。西瓜种子是最常见和易获得的样品材料之一，但很少直接用于DNA提取，仅国外有从西瓜种子中提取DNA的报道[5]。在实际研究和工作中为了提高效率，可能需要对现有的特定类型西瓜样品进行DNA提取，如进行种子纯度分子标记检测时，若能从种子样品中提取DNA，而不必播种育苗后从真叶提取DNA，可以缩短鉴定时间1周以上，对于快速实现种子纯度检测具有重要意义。为此笔者以西瓜种子、下胚轴、子叶、种芽（下胚轴+子叶）、新鲜真叶和干燥真叶6种不同类型样品为试验材料，比较不同类型样品的DNA提取数量和质量，并对提取的DNA进行dCAPS扩增和酶切，判断不同类型西瓜样品中提取的DNA在分子生物学研究中的应用价值，为合理利用西瓜样品材料提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2016年3—7月在中国农业科学院郑州果树研究所进行，以来自国家西瓜甜瓜中期库的西瓜种质资源父本‘14CB11’（感枯萎病）、母本‘Sugarlee’（抗枯萎病）及杂交F1为研究材料，种子经过25℃清水浸种24 h后用棉布包裹，于32℃条件下恒温催芽48 h，然后播种于营养钵中育苗，取催芽前备份的单粒种子，以及催芽或育苗后的下胚轴、种芽（下胚轴+子叶）、子叶、新鲜真叶各0.05 g为材料，另取0.05 g新鲜真叶置于国家西瓜甜瓜中期库种质保存冷库中（5℃，40%相对湿度）放置72 h后脱水为干燥真叶，一起用于DNA提取研究。

1.2 DNA提取

采用天根DNA提取试剂盒［由天根生化科技（北京）有限公司生产］进行提取，提取方法参照天根DNA提取试剂盒操作说明书的操作步骤并略加改进，改进地方为将操作步骤第4步的GP2替换为预冷的0.7倍体积异丙醇，以增加DNA析出产量。

1.3 DNA检测

采用 Nano Drop 1000（Thermo Scientific）微量紫外分光光度计对提取的DNA进行检测，对提取DNA的含量、OD260/280值和OD260/230值进行测量和计算，同一类型样品提取DNA的检测结果计算平均值。

1.4 dCAPS扩增

采用2×Taq Master Mix（北京百泰客生物技术有限公司生产）进行PCR反应，反应体系为25μL，包括 2×Taq Master Mix 12.5μL，模板 DNA 2.0μL，10 μmol·μL-1上、下游混合引物 2.0 μL，ddH2O 8.5μL；扩增反应程序为94℃预变性5 min；94℃20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，34个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。

dCAPS引物为国内公开发表的抗枯萎病生理小种1紧密连锁的dCAPS标记502124_fon[6]，该标记引物信息如下：

上游引物序列为5′-AACACCACCCACTTTG⁃GAGCTTCG-3′，下游引物序列为 5′-TTTTAGGGT⁃GAAAATGGGTATTGTA-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 dCAPS酶切

dCAPS产物采用内切酶Taq I进行酶切，酶切识别位点为 T’CGA，酶切体系为：10×Buffer 1.5 μL，限制内切酶1.0μL；dCAPS扩增产物5.0μL，ddH2O 7.5μL，总体系为15.0μL。酶切程序为：65℃条件下酶切16 h，80℃条件变性20 min，4℃保存，Taq I来自Fermentas公司。

1.6 电泳

扩增/酶切产物采用8.0%非变性聚丙烯酰胺电泳，280 V恒定电压下电泳50 min，银染染色，拍照分析，以判断不同类型样品中提取的DNA的dCAPS扩增和酶切效果。

dCAPS产物酶切后电泳出116 bp条带判定为感病纯合基因型，出现单条带94 bp为抗病纯合基因型，同时出现116 bp和94 bp 2条带为抗病杂合基因型。

2 结果与分析

2.1 不同类型样品DNA提取结果

采用改进的试剂盒提取方法均可以不同类型的西瓜样品中提取出DNA，其中新鲜真叶和干燥真叶提取的DNA质量浓度最大，分别为 1 130.18、1 039.74 ng·μL-1，二者比较接近，表明西瓜真叶经过低温干燥后对DNA的提取量影响不大；子叶、下胚抽、种芽稍低，质量浓度分别为434.33、406.21、428.98 ng·μL-1，而种子中提取的DNA 质量浓度最低，为 55.08 ng·μL-1。

表1 不同类型西瓜样品提取DNA的检测结果

2.2 不同类型样品提取DNA的dCAPS扩增及酶切

全部样品中提取的DNA均可扩增出条带，电泳背景干净，条带清晰，大小在116 bp附近，与该引物开发的信息相符，表明采用改进的DNA试剂盒提取方法从西瓜种子、子叶、下胚轴、种芽、新鲜真叶和干燥真叶提取的DNA可以满足dCAPS扩增的需求，提取的DNA样品中残留的RNA和盐分对dCAPS扩增没有明显的影响（图1）。

酶切结果表明，感病母本的dCAPS扩增产物被酶切成94 bp，抗病父本的dCAPS扩增产物未被酶切，而杂交1代扩增产物出现了94 bp和116 bp的共显性条带，各类型样品提取的DNA扩增产物酶切正常，酶切片段大小一致，表明不同类型样品中提取的DNA可以满足dCAPS酶切的需求。

图1 西瓜不同类型样品中提取DNA的d Caps扩增与酶切结果

3 讨论与结论

笔者采用改进的DNA试剂盒提取法对西瓜种子、下胚轴、子叶、种芽、新鲜真叶和干燥真叶共6种样品进行了DNA提取，结果表明从各样品中均可有效提取DNA，但提取的DNA质量浓度相差比较大，如从真叶提取的DNA质量浓度在1 130 ng·μL-1左右，而从种子中提取的DNA质量浓度仅为55 ng·μL-1左右，2者相差20倍左右，出现这种情况是否与样品中DNA含量差异或提取效率有关，有待于进一步研究。

利用种子提取 DNA 已经在棉花[7-10]、大豆[1，11-13]、玉米[14-17]、水稻[18-19]和小麦[20-21]等作物上实现，在同为葫芦科园艺作物的甜瓜上也有从种子中提取DNA的报道[22]。西瓜种子富含氨基酸和脂肪酸[23]，可能会对DNA提取有不利影响，笔者曾采用常规的CTAB法和SDS法进行过多次提取，均无法有效提取DNA，而本研究采用改进的DNA试剂盒提取法成功地从西瓜种子中提取出DNA，表明从西瓜种子中提取DNA有较大的改进和提高的空间。

dCAPS扩增涉及错配碱基的扩增，对DNA质量要求较高，笔者在dCAPS操作中曾发现，提取的DNA在4℃冰箱中保存一段时间后虽然能够扩增出条带，但扩增产物却无法被酶切出目的条带，笔者用改进的DNA试剂盒提取法使用了吸附柱，能够通过吸附作用进一步去除杂质，提高DNA的质量，所提取的DNA可以满足dCAPS扩增及酶切的需求，根据本研究结果，按照研究目的和具体的试材条件，可以选择从种子到种芽、育苗和瓜苗生长过程中的任一样品提取DNA用于西瓜分子生物学的研究。