王　卓,索菲娅,安秀峰,张　婷,罗静莺

(新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046)



响应面法优化孜然总酚含量测定的工艺条件

王卓,索菲娅*,安秀峰,张婷,罗静莺

(新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐 830046)

以新疆孜然为原料,采用超声波辅助浸提法优化孜然总酚提取的工艺条件。采用福林酚法测定总酚含量,在单因素基础上,考察乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度对孜然总酚含量测定的影响,通过方差分析对提取过程显著影响含量测定的因素进行统计分析。结果表明,孜然总酚提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度70%、料液比1∶20、超声温度60 ℃、超声时间60 min。在该条件下,孜然总酚的实测含量为13.8 mg/g,与预测值相差约4.5%,比回流提取法含量测定提高了139%,说明通过响应面优化可较大提高孜然总酚的测定含量。

孜然,总酚,单因素,响应面分析法

孜然(CurcumincymlinL.),学名枯茗,也叫孜然芹、安息茴香、野茴香,隶属于伞形科孜然属,一年生或二年生草本植物。孜然是少数民族用药,维药认为孜然具有醒脑通脉、降火平肝等功效,能祛寒除湿,理气开胃,对消化不良、胃寒疼痛、肾虚便频均有疗效[1-2]。孜然化学成分为多糖类、酚类、烯烃类、黄酮类、萜类等多种成分[3]。植物多酚具有抗氧化、清除自由基、增强免疫力、抗肿瘤和抗病毒等生物活性,对肥胖、高血脂、Ⅱ型糖尿病、癌症等慢性疾病的预防和控制有积极作用。超声波具有能耗低、效率高、不破坏有效成分等特点,适合热敏物质的提取。目前国内外对孜然果实中挥发油的成分和生物活性研究较多[4-9]。对孜然总酚的提取及其相关活性的研究则鲜见报道[10-11]。本实验以新疆孜然为原料,采用超声波辅助浸提法对孜然总酚进行提取,优选出超声波辅助浸提法测定孜然总酚的最佳工艺条件,以期为孜然总酚进一步开发利用提供数据参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新疆孜然吐鲁番,经新疆大学生命科学与技术学院索菲娅副教授鉴定为孜然(CurcumincymlinL.)。

福林酚(Folin&Ciocalteu’s phenol reagent批号YY12202)上海源叶生物科技有限公司;(+)-儿茶素对照品(批号YY90158)上海源叶生物科技有限公司。

Spectrumlab53紫外可见分光光度计上海棱光技术有限公司;KQ-250DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司;AL104分析天平北京赛利多斯仪器系统有限公司;酶标仪Benchmark plus,BIO-RAD,上海第三分析仪器厂。DG160C型中药材粉碎机浙江春海药材器械厂;循环水式真空泵巩义予华仪器有限责任公司;CCA-1100型旋转蒸发仪东京理化器械株式会社。

1.2实验方法

1.2.1样品溶液的制备准确称取干燥孜然粉1.00 g,置于100 mL具塞锥形瓶中,加入不同乙醇浓度在不同温度下超声提取规定时间,抽滤定容至100 mL,即得。

1.2.2总酚含量测定采用Folin-Ciocalteu法[12]改进为:移取提取液0.5 mL,加入5 mL的稀释10 倍Folin-Ciocalteu试剂,摇匀后,静置反应5 min,再加入7.5%的Na2CO3溶液4 mL,加入1.5 mL蒸馏水至反应体系为11 mL,摇匀,室温放置60 min,在波长725 nm处测定吸光度。采用(+)-儿茶素为对照品,获得(+)-儿茶素的标准曲线,根据标准曲线算出孜然提取液总酚的质量浓度,以(+)-儿茶素当量表示,单位为mg/g。总酚提取量(mg/g)=C×V×n/M,式中:C为(+)-儿茶素的质量浓度(mg/mL);V为溶液体积(mL);n为稀释倍数;M为取样量(g)。

1.2.3单因素实验采用超声波辅助提取,考察乙醇浓度、料液比、超声温度、超声时间、超声功率、粒度对总酚提取含量测定的影响。通过固定上述任意五个影响因素的值,变化单一影响因素考证其对孜然总酚提取量的影响。固定值分别为乙醇浓度60%、料液比1∶10、超声温度40 ℃、超声时间30 min、超声功率200 W、粒度60目。

考察乙醇浓度对孜然总酚含量测定的影响,固定料液比1∶10、超声温度40 ℃、超声时间30 min、超声功率200 W、粒度60目,在乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%的条件下进行提取含量测定。

考察料液比对孜然总酚含量测定的影响,固定乙醇浓度60%、超声温度40 ℃、超声时间30 min、超声功率200 W、粒度60目,在料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的条件下进行提取含量测定。

考察超声温度对孜然总酚含量测定的影响,固定料液比1∶10、超声温度40 ℃、超声时间30 min、超声功率200 W、粒度60目,在超声温度分别为20、30、40、50、60、70 ℃的条件下进行提取含量测定。

考察超声时间对孜然总酚含量测定的影响,固定乙醇浓度60%、料液比1∶10、超声温度40 ℃、超声功率200 W、粒度60目,在超声时间分别为10、20、30、40、50、60 min的条件下进行提取含量测定。

考察超声功率对孜然总酚含量测定的影响,固定乙醇浓度60%、料液比1∶10、超声温度40 ℃、超声时间30 min、粒度60目,在超声功率分别为100、150、200、250 W的条件下进行提取含量测定。

考察粒度对孜然总酚含量测定的影响,固定乙醇浓度60%、料液比1∶10、超声温度40 ℃、超声时间30 min、超声功率200 W,在分别过60、70、90、100目筛的情况下进行提取含量测定。

在到达最大灌浆速率时间（Tmax）方面，外缘籽粒达到最大灌浆速率的时间为16～20 d，中部部籽粒在 20～22 d，而内部籽粒在 22～27 d，表明外缘籽粒的灌浆速度快，内部籽粒较慢；其中在深松45 cm（S45），密度D1时外缘籽粒达到最大灌浆速率的时间最短为16.11 d。不同粒位向日葵的灌浆速率最大时的籽粒重（Wmax），灌浆速率最大时的籽粒重占最终籽粒重的百分率（I）均表现为外缘籽粒＞中部籽粒＞内部籽粒，其中外缘籽粒Wmax和I在S45，密度为D1时最大，分别为5.543 g/（粒·d），62.53%。

每组实验设置三个平行,测定结果取平均值,实验数据采用GraphPad Prism5.01处理。

1.2.4响应面实验设计根据Box-Behnken实验设计原理,选取乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度4个因素为考察对象,总酚提取量为响应值,研究各自变量及其交互作用对孜然总酚提取量的影响,建立预测模型并获取最佳工艺参数。实验水平分析表见表1。

表1　响应面实验设计因素与水平

2　结果与分析

2.1单因素实验结果与分析

图1中A,随着乙醇浓度的增大,孜然总酚的提取量呈现先增加后减少的趋势。当乙醇浓度为60%时,孜然总酚的提取量达到最高值,此后随着乙醇浓度的增大,总酚提取量逐渐降低,这是因为随着乙醇浓度的增加,总酚类物质在乙醇溶液中的溶解度增加,当乙醇浓度达到60%以后,溶液极性增强,溶剂与总酚极性的相似程度降低,导致总酚物质的溶解度下降。因此最佳乙醇浓度选择为60%。

图1　乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声温度(C)、超声时间(D)、超声功率(E)及粒度(F)对总酚含量的影响Fig.1　Effects of ethanol concentration(A),solid/liquid ratio(B),ultrasonic temperature(C),ultrasonic time(D),ultrasound power(E)and granularity on the extraction yield of polyphenol from Curcumin cymlin L.

图1中B,随着料液比的增大,孜然总酚的提取量也随之增加,这是由于当样品量一定时,增加溶剂的量可以降低样品颗粒周围有效成分的浓度,从而增加原料与有机溶剂接触面的浓度差,提高了总酚向溶剂的扩散速度,更有利于总酚的溶出。当料液比超过1∶10后,总酚的提取量逐渐减少,这是由于随着料液比的不断增加,提取液总酚浓度降低,总酚类物质溶出速度减慢,导致提取量减少。

图1中C,超声温度在20～40 ℃时,随着超声温度的升高,孜然总酚提取量呈上升趋势。当超声温度为40 ℃时,总酚的提取量达到最高值,此后,总酚提取量随超声温度的升高呈下降趋势。这是因为温度升高,溶剂的表面张力系数及粘滞系数下降,蒸汽压增大,超声空化阈值下降,有利于空化泡的产生,但蒸汽压增加,又会导致空化强度或空化效应下降,从而不利于提取过程的强化,过高的温度还可使总酚自身氧化。由此得出:40 ℃为较优的超声提取温度。

图1中D,超声时间对孜然总酚提取量有一定的影响,当超声时间10～30 min范围时,随着超声波处理时间的延长,孜然总酚提取量呈上升趋势。当超声时间超过30 min后,孜然总酚提取量开始下降。这是因为超声波对细胞壁有破坏作用,随着提取时间的延长,破坏作用程度加大,溶出物增多,提取量相应提高;继续延长超声处理时间,由于总酚类物质的结果被破坏,导致提取量下降。由此得出:30 min为超声处理的最佳时间。

图1中F,随着粒度的减小,孜然总酚提取量不断下降。这是由于随着孜然粒度的下降,颗粒中油性成分含量很高,限制了总酚的提取。由此得出:选择孜然粉碎后,过60目筛为总酚提取的最佳粒度。

在响应面实验设计因素的选取上,考虑到粒度对孜然总酚提取液含量测定影响明显,选择单因素测定总酚含量最高的60目为固定值,另外本实验室数控超声波清洗器最大输出功率为250 W,考虑到长时间多组实验对仪器的耗损,选择单因素测定总酚含量较高时的超声功率200 W为固定值,考察不同乙醇浓度、料液比、超声温度、超声时间对孜然总酚含量测定的影响。

2.2响应面实验结果与分析

由表3可知,该回归模型p<0.0001,表明回归模型达到极显著水平,而失拟项p=0.07>0.05,表明差异不显著,说明残差均由随机误差引起,未知因素对实验结果干扰小,方程对实验拟合较好。根据F值可知,影响因子的主效应主次顺序为:超声温度(X3)>乙醇浓度(X1)>超声时间(X4)>料液比(X2)。

2.3建立模型方程与显著性检验

利用Design-Export V8.0.6.1统计软件对表2中的实验数据进行回归拟合,得到孜然总酚提取量(Y)与乙醇浓度(X1)、料液比(X2)、超声温度(X3)、超声时间(X4)的二次多项回归模型为:

Y=11.22+1.76X1+1.06X2+1.79X3+1.27X4+0.36X1X2+0.38X1X3-0.5X1X4+0.67X2X3+0.48X2X4+0.27X3X4+0.13X12+0.056X22-0.47X32+0.65X42。该回归方程的决定系数R=0.9660,说明该模型拟合良好。

2.4响应面图与结果分析

图2为各因素交互作用对孜然总酚得率的响应面,反映了自变量X1、X2、X3、X44个因素任意两个自变量取零水平时,其他两个因素的交互作用对孜然总酚提取量的影响情况。比较各图表可知:乙醇浓度和超声温度的曲线相对较陡,说明乙醇浓度和超声温度对孜然总酚提取量的影响较为显著。而料液比的曲线平缓,响应值较小,说明料液比对孜然总酚提取量的影响不显著。由图2中等高线可看出乙醇浓度与超声时间、乙醇浓度与超声温度、超声时间与超声温度的交互作用较强,对孜然总酚提取量的影响显著。由图可看出乙醇浓度与料液比、超声时间与料液比、超声温度与料液比交互作用较弱,对孜然总酚提取量的影响不显著[13]。

表2　响应面实验结果

表3　回归方程的方差分析

注：**表示极显著(p<0.01)。

2.5最优条件的确定及验证实验

根据回归模型通过Design-Export V8.0.6.1软件对实验结果进行分析处理,得到超声辅助提取孜然总酚的最优条件为:乙醇浓度69.97%、料液比1∶20、超声温度60 ℃、超声时间60 min,在此条件下,模型预测的最大总酚提取量为13.2 mg/g。考虑到实际操作的局限性,各因素分别取整,修正为:乙醇浓度70%、料液比1∶20、超声温度60 ℃、超声时间60 min。在此条件下进行3次验证实验,孜然总酚提取量的平均值为13.8 mg/g,与预测值相差4.5%。

回流提取法获得孜然总酚[10],含量测定最高为5.77 mg/g,对比超声辅助最佳条件下孜然总酚含量测定,后者比回流提取法测定含量提高139%。

图2　乙醇浓度(A)与料液比(B)、乙醇浓度(A)与超声时间(C)、乙醇浓度(A)与超声温度(D)、料液比(B)与超声时间(C)、料液比(B)与超声温度(D)、超声时间(C)和超声温度(D)对总酚提取量的影响Fig.2　Response surface plot showing the effects of Ethanol concentration and Solid/liquid ratio,Ethanol concentrationand Ultrasonic time,Ethanol concentration and Ultrasonic temperature,Solid/liquid ratio and Ultrasonic time,Solid/liquid ratio and Ultrasonic temperature,Ultrasonic time and Ultrasonic temperature on extraction yield of polyphenols from Curcumin cymlin L.

3　结论

利用响应面实验设计优化了孜然总酚的提取工艺,建立其多元二次优化模型方程,结果显示乙醇浓度、超声温度对孜然总酚含量测定均有极显著的影响(p<0.01)。孜然总酚超声辅助提取工艺参数与提取量的数学模型回归显著,拟合程度较好,能够应用于孜然中总酚的回归分析和参数优化。优化后孜然总酚含量测定显著提高,可为进一步研究孜然总酚提供数据支持。

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Content determination of polyphenol fromCurcumincymlinL. using response surface method

WANG Zhuo,SUO Fei-ya*,AN Xiu-feng,ZHANG Ting,LUO Jing-ying

(College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

The polyphenol from XinjiangCurcumincymlinL. was abstracted by ultrasonic-assisted extraction,and the extraction yield was measured by Lowry method with Folin phenol.According to single-factor test,the extraction yield was determined by the method of response surface analysis(RSA)with four factors(the ethanol concentration,solid/liquid ratio,ultrasonic time and ultrasonic temperature),And the notability difference was analyzed with the statistic method of ANOVA. Results showed that the optimal conditions were as follows:ethanol concentration 70%,solid/liquid ratio1∶20,ultrasonic time 60 min,ultrasonic temperature60 ℃.Under such conditions,the actual amount of polyphenols extracted for 13.8 mg/g,with a difference of 4.5% compared with predictive value,this method of extracting higher than 139% with reflux extraction.Optimization of Using Response Surface Methodology can greatly improve the content determination of polyphenols from XinjiangCurcumincymlinL.

CurcumincymlinL.;polyphenol;single factor;response surface analysis

2015-11-16

王卓(1990-),男,在读硕士研究生,主要从事药用植物资源研究工作,E-mail:869385044@qq.com。

索菲娅(1964-),女,硕士,副教授,主要从事植物资源、植物化学和新药的研发工作,E-mail:2576931152@qq.com。

国家自然科学基金项目(31160073);新疆维吾尔自治区科技厅支疆项目(N0.201091245)经费支持。

TS255.1

B

1002-0306(2016)11-0195-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.032