储雯雯，刘　周，杨　凯，管世鹤

碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌耐药机制及分子流行病学研究

储雯雯，刘周，杨凯，管世鹤

目的 探讨临床分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药基因及分子流行病学研究。方法 收集并鉴定临床分离非重复碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌株44株。采用Vitek 2 compact全自动微生物鉴定药敏分析仪鉴定进行常规药敏试验，改良Hodge试验检测KPC型碳青霉烯酶，EDTA协同法检测金属β-内酰胺酶，聚合酶链反应（PCR）法检测细菌携带的耐药基因。肠杆菌基因间重复性共有序列ERIC-PCR对菌株进行同源性分析，了解其分子流行病学特征。结果44株肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗菌药物显示了较高的耐药性。改良Hodge试验阳性41株，金属酶检测试验结果均为阴性。PCR结果显示，临床分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌以KPC-2型为主，共42株。ERIC-PCR将44株肺炎克雷伯菌分为14型，以Ⅰ型为主，共18株，集中于重症监护室（ICU）和神经外科。结论分离的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌对临床常用抗菌药物表现出高水平耐药；其耐药机制主要是该类细菌产KPC-2碳青霉烯酶，ICU与其它科室的患者频繁转诊治疗可能是导致碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌在全院范围播散流行的主要原因。

肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；ERIC-PCR；KPC-2

网络出版时间：2016-5-9 15：43：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.022.html

肺炎克雷伯菌作为在临床常见的院内感染致病菌之一，主要引起肺炎、败血症、尿路炎症等疾病，现在临床治疗产ESBL及多重耐药肺炎克雷伯菌感染的首选药物是碳青霉烯类抗生素，但是近年来因为碳青霉烯类抗生素泛滥性的应用，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia，CRKP）的比例逐渐增高，呈全球播散趋势，成为临床抗感染治疗的严重威胁［1-2］。尤其在我国，CRKP分离率更是逐年攀升，正在以极其迅猛的速度流行，而导致其广泛播散的主要原因则是碳青霉烯酶可广泛水解包括碳青霉烯类抗生素在内的所有β-内酰胺类抗生素，并且因为可以被质粒携带而导致大范围的流行［3］，在对临床治疗带来极大挑战的同时也给临床耐药方面带来了严重的问题。该研究在深入了解CRKP中碳青霉烯酶的分布情况、耐药机制及其分子流行病学特征的基础上，根据其同源性分析院内感染流行现状，为有效控制CRKP的流行提供科学的理论依据。

1　材料与方法

1.1菌株来源 收集2013年2月～2015年6月安徽医科大学第二附属医院临床标本中分离的非重复CRKP 44株。菌株经Vitek 2 compact全自动微生物鉴定药敏分析仪鉴定及药敏试验，按美国临床和实验室标准化协会（CLSI）2013版标准判定，筛选出对碳青霉烯类药物非敏感菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705和ATCCBAA-1706购自卫生部临床检验中心。金属酶阳性菌株为产IMP-1型金属酶的铜绿假单胞菌。

1.2仪器与试剂 全自动微生物鉴定仪Vitek 2 compact购自法国梅里埃公司；Flexcycler型梯度PCR扩增仪购自德国Analytikjena公司；Tanon1600型全自动凝胶成像分析系统购自上海天能科技有限公司；电泳仪购自美国Bio-red公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；PCR实验过程试剂、电泳用DNA Marker、PCR Master Mix（2×）等相关试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司；美洛培南纸片（10 μg/片）和亚胺培南（30 μg/片）购自英国Oxoid公司。

1.3药敏实验 采用法国梅里埃公司GN13鉴定药敏复合板进行常规药敏试验，检测抗菌药物包括：头孢曲松、头孢吡肟、头孢他啶、氨曲南、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、厄他培南，美洛培南用K-B法进行检测，大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株，操作方法及结果判断参照CLSI标准。

1.4改良Hodge试验 先调0.5麦氏单位的大肠埃希菌（ATCC25922）菌液，然后将稀释10倍的菌液均匀涂布在MH琼脂平板上，将美洛培南纸片（10 μg/片）贴在中间位置后用接种环挑取新鲜待测菌株从纸片边缘向外划直线，要求直线呈放射样分布。35℃培养18～24 h，美洛培南抑菌圈处出现被检菌增强（矢状）生长者为改良Hodge试验阳性，提示该菌株产碳青霉烯酶。

1.5EDTA协同试验检测金属酶 采用亚胺培南和乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）纸片的双纸片协同法。按K-B法涂布新鲜待测菌于MH琼脂平板，在MH琼脂平板一侧贴一张亚胺培南纸片（30 μg/片），并将一张空白纸片贴在亚胺培南纸片另一侧，使两纸片边缘之间的距离为10～15 mm，然后在空白纸片上滴加0.5 mol/L的EDTA溶液10 μl，置35℃孵育24 h后观察结果，在含EDTA的空白纸片方向处亚胺培南抑菌圈扩大者，为协同试验阳性，可判定该菌株产金属β-内酰胺酶［4］。

1.6耐药基因检测 煮沸法提取细菌DNA，PCR方法扩增KPC-2及其他常见的碳青霉烯耐药基因如NDM-1、SME、OXA-48、GES、VIM、IMP等，PCR扩增引物条件参考文献［5］，引物序列见表1。PCR反应体系共50 μl，25 μl PCR mix试剂，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，DNA模板1 μl，双蒸水22 μl。反应参数：95℃预变性5 min，95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、50 s，共35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统显像观察结果。

表1　目的基因引物序列及长度

1.7染色体DNA同源性分析 肠杆菌基因间重复共有序列ERIC-PCR分析耐药菌株同源性，ERICPCR引物序列［6-7］为ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃、45 s，40℃、1 min，65℃、8 min，30个循环，最后延伸65℃、16 min，产物经12 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析。

2　结果

2.1菌株来源及分布 44株菌株主要来自于重症监护室（ICU）（10例）、呼吸内科（6例）、神经内科（2例）、神经外科（13例）、急诊内科（2例）、急诊ICU（EICU）（4例）、泌尿外科（1例）、普外科（1例）、血液内科（4例）、肝病科（1例）等，标本类型为痰（31例）、尿液（7例）、全血（3例）、腹水（1例）、脑脊液（1例）及切口分泌物（1例）。

2.2抗菌药物敏感度试验结果 44株CRKP经药敏鉴定后均表现为对碳青霉烯类药物耐药，有95%以上的CRKP对头孢类药物耐药，见表2。

表2　CRKP对15种抗菌药物的耐药性分析［n=44，n（%）］

2.3改良Hodge试验与EDTA协同试验试验结果44株肺炎克雷伯菌中改良Hodge试验阳性41株，阳性率93.2%，EDTA协同试验检测试验结果均为阴性。见图1。

2.4耐药基因检测结果 PCR结果显示KPC-2阳性检出率最高为42株，见图2。未检出NDM-1、SME、IMP、OXA-48、VIM、GES阳性菌株。

2.5同源性分析结果 用ERIC-PCR的方法对44株CRKP DNA扩增，根据琼脂糖凝胶电泳的条带的结果进行基因分型，根据细菌同源性标准［8］，44耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌产生的扩增条带数在3～7，形成指纹图谱，见图3。44株肺炎克雷伯菌根据ERIC-PCR产物电泳分为14个亚型：Ⅰ型18株、Ⅱ型5株、Ⅲ型4株、Ⅳ型3株、Ⅴ～Ⅷ型各2株、Ⅺ～XIV型各1株，各型的临床分布见图4。

图1　表型实验A：Hodge试验；B：EDTA协同试验

图2　部分分离肺炎克雷伯菌株KPC-2基因琼脂糖凝胶电泳结果M：DL 2000 DNA Marker；P：阳性对照，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705；N：阴性对照，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706；1～11：KPC-2基因阳性菌株；12：KPC-2基因阴性菌株

图3　部分耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的ERIC-PCR指纹图谱M：DL 2000 DNA Marker；1～21：1～21号肺炎克雷伯菌株指纹图谱

图4　14型CRKP各科室分布情况

3　讨论

肺炎克雷伯菌感染在临床非常常见，通过翻阅临床病例资料，显示在感染肺炎克雷伯菌的患者里，大部分进行过有创性操作包括深静脉置管、气管插管、胃肠减压或者患有肠梗阻、肠穿孔等致肠道菌群明显异位的疾病，从而反映出肺炎克雷伯菌条件性致病菌的特点—易发生于免疫力低的老年人或婴幼儿、有基础疾病（糖尿病或肾病）、住院时间较长、接受有创性医疗操作的患者，特别是ICU的患者更是易感人群。通过每年细菌耐药网监测，碳青霉烯类药物在治疗肺炎克雷伯菌的同时也造成细菌耐药率逐年增高，CRKP引起的感染在细菌感染性疾病中所占的比重也日渐增加，其严峻形势已不容乐观［9］。

本研究中，44株CRKP对头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南的耐药率都为90%～100%，对阿米卡星的耐药率为68.2%，对左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率为65.9%和72.7%，对培南类药物的耐药率为97%～100%，符合KPC酶能够水解各种临床常规使用抗菌药物的报道［10］，以上数据表明我院分离的CRKP多为高水平耐药的多重耐药菌。

44株临床分离的CRKP，改良Hodge试验阳性有41株，阳性检出率为93.1%。而根据碳青霉烯酶基因检测共检出42株基因阳性菌株，检出率为95.5%，以上数据表明KPC-2基因检测的阳性率比改良Hodge试验高，因此在碳青霉烯酶的初步筛查中可以做改良Hodge试验，若要进一步区分确认还需做碳青霉烯酶基因检测。

碳青霉烯酶的基因位于可转移的质粒上，依靠多种基因元件进行传播，获得性耐药基因和可移动遗传元件是引起肺炎克雷伯耐药的重要机制［11-12］，这也是多重耐药菌株易于传播的重要原因［13］。CRKP有多种耐药机制，包括产碳青霉烯类水解酶，外膜蛋白缺失，产大量ESBL或AmpC酶，细菌细胞壁上PBP改变，产生主动外排泵等，其中产碳青霉烯水解酶占主要因素，特别是KPC-2、NDM型碳青霉烯酶是医院感染重点关注对象。本研究中表明我院KPC-2型碳青霉烯酶的检出率为95.5%，说明在产KPC-2肺炎克雷伯菌已在我院成流行趋势。

结合ERIC-PCR结果，根据临床流行病学资料分析，本研究中产KPC-2酶的肺炎克雷伯菌主要有两个克隆群出现院内播散，分别是Ⅰ型和Ⅱ型克隆群。其中Ⅰ型克隆群是最主要的型别，涉及神经外科、ICU、血液内科、神经内科和普外科，从2013年5月～12月均有流行，估计与ICU频繁出现与其它科室的患者相互转诊治疗的情况有关，其可能是导致该菌株在全院范围播散流行的主要原因［14］。因此，其可能是导致Ⅰ型克隆菌株播散至全院的中间关键环节。在Ⅰ型克隆群中可以明显发现在ICU和神经外科病房的菌株播散现象。神经外科一般以脑外伤患者居多，手术难度大，术后病情需要多方位监护，需在术后进ICU观察。而其他入住ICU的患者主要为病情严重和免疫水平低下者，易反复感染而需要长期使用多种抗菌药物治疗，使ICU病区成为多重耐药菌容易爆发流行的地方，也是造成克隆株流行的原因［15］。Ⅱ型克隆群涉及ICU、神经外科和神经内科。也可见Ⅱ型克隆群在ICU内有短期传播流行现象发生。其它各克隆群主要是散发于临床科室，并未造成播散流行。因此，使用抗菌药物治疗前，要做好药敏检测工作，同时将环境的清洁与消毒做到位，已感染患者和未感染患者隔离开等，阻断该类耐药菌的传播。

为了预防院内感染和多重耐药菌在院内传播和暴发流行，临床医师和检验科医师应协同合作、加强彼此间沟通；微生物室增加药敏检测的种类，为临床医师提供更多的选择；协助院感办对临床进行监督。为了减少耐药菌株的出现，检验科要提供准确药敏实验结果，临床医师在此基础上结合病情合理用药，尤其是要高效广谱类的抗菌药物一定要慎重，以防发生可选用抗菌药物非常有限甚至无药可用的情况。

综上所述，早期预防和治疗是阻止院内感染和多重耐药菌院内传播的重中之重，只有科学使用抗菌药物，加强对多重耐药菌的监测和流行病学研究，并及时采取有效措施才能预防该类细菌导致医院感染的流行。

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Analysis of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae molecular epidemiology and antibiotic resistance gene

Chu Wenwen，Liu Zhou，Yang Kai，et al
（Dept of Clinical Laboratory，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the molecular epidemiology characteristics and drug resistance genes of imi-penem-resistant Klebsiella pneumoniae isolated.Methods A total of 44 strains of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae were collected and identified.Conventional drug susceptibility test was made by Vitek 2 compact automatic microbe susceptibility analyzer appraisal.Susceptibility testing for antibiotics was performed by the disc diffusion method carbapenemase production was confirmed by modified Hodge test and MBL production by IPM/IPMEDTA combined disc test.The resistant genes were detected by PCR.Molecular epidemiology characteristics were analyzed by enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence（ERIC）-polymerase chain reaction（PCR）.Results A total of 44 strains of bacteria showed a high level resistance to routine antibiotics including carbapenems，penicillins，cephalosporin and aztreonam.A total of 41 strains were positive in modified Hodge test and all the 44 strains were negative to enzyme detection test.PCR result showed that 42 strains were of KPC-2 type，none of other gene types.ERIC-PCR result showed that 44 strains of Klebsiella pneumoniae were divided into 14 types，and the main type was type I.18 strains belonged to type I from ICU and neurosurgery.Conclusion Klebsiella pneumoniae that resists to carbapenem shows high levels of resistance to routine antibiotic in our hospital.Strains of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae appear，KPC-2 is the main reason to cause the bacterial resistance to carbapenems. Frequent transfer treatment of the patients among ICU and other clinical departments is the primary factor of carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia epidemic in the entire hospital.

Klebsiella pneumoniae；carbapenemases；ERIC-PCR；KPC-2

R 378.1

A

1000-1492（2016）06-0809-05

2016-04-14接收

国家自然科学基金（编号：81171662）

安徽医科大学第二附属医院检验科，合肥 230601

储雯雯，女，检验主管技师，硕士研究生；管世鹤，男，教授，主任技师，博士生导师，责任作者，E-mail：shiheguan@126.com