杨　洋，徐　燕，孟明理，汪　晨，王　敬，王晓静，周永敏，沈继龙

牙龈卟啉单胞菌对牙周膜成纤维细胞活性、炎性因子与骨代谢基因表达的影响研究

杨洋1，徐燕1，孟明理1，汪晨1，王敬1，王晓静1，周永敏1，沈继龙2

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）活菌感染牙周膜成纤维细胞（PDLF）后对细胞活性、炎性因子和骨代谢相关基因表达的影响。方法 P.gingivalis活菌分别以109、108、107、106、105CFU/ml浓度感染PDLF 6 h，检测细胞活性和白细胞介素-6（IL-6）、IL-8、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、RANKL、骨保护素（OPG）的基因表达。结果P. gingivalis攻击PDLF 6 h后，细胞活性差异无统计学意义。与对照组比较，P.gingivalis浓度分别达到108CFU/ml和107CFU/ml时，IL-6和IL-8基因表达上升，差异有统计学意义（P＜0.01），P.gingivalis浓度达到109CFU/ml时，IL-1β、TNF-α基因表达上升，差异有统计学意义（P＜0.01）。各实验组OPG基因表达均下降，差异有统计学意义（P＜0.01），RANKL基因表达差异无统计学意义。结论 P.gingivalis活菌感染PDLF后，可产生一系列的细胞因子，参与牙周组织的破坏与改建。

牙龈卟啉单胞菌；牙周膜成纤维细胞；细胞因子；破骨细胞

网络出版时间：2016-5-9 15：43：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.012.html

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）是慢性牙周炎的主要致病菌，含有一系列的毒力因子。其中脂多糖、菌毛、牙龈素等是P.gingivalis表面最重要的致病因子。脂多糖可刺激巨噬细胞分泌多种细胞因子和炎症介质，牙龈素可通过大量的蛋白水解活动侵袭破坏宿主组织。P.gingivalis可侵入宿主细胞、抵抗宿主先天性免疫系统、分泌大量毒力因子、引发机体的免疫炎症反应，进而导致牙周组织的破坏［1］。牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts，PDLF）是牙周膜中最主要的细胞［2］，对于牙周炎的发生发展以及组织修复和改建具有重要作用。炎症状态下，PDLF可表达细胞因子并与破骨前体细胞表面的受体连接进而刺激其向破骨细胞分化［3］。该研究旨在观察P.gingivalis体外对PDLF的攻击，探讨P.gingivalis对PDLF活性、细胞因子和骨代谢的基因表达的影响，以期为进一步研究P.gingivalis对PDLF的作用机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1主要材料和试剂 DMEM培养基、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（杭州四季青公司）；RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）；台盼蓝（美国Sigma公司）；倒置相差显微镜（德国Leica公司）；P.gingivalis（ATCC33277，本课题组平行实验赠予）；紫外可见分光光度计UV-7504（上海欣茂仪器有限公司）；Countstar细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）。

1.2PDLF的分离培养取 12～22岁因正畸减数拔除的健康前磨牙，运用组织块法用刀片刮取根中1/3部位的牙周膜，将组织块置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中于37℃、5%CO2培养箱中进行培养［2］。

1.3P.gingivalis活菌体外感染PDLF 取第3～4代PDLF，胰酶消化离散细胞，含10%FBS的DMEM重悬，以2×105/ml密度接种于6孔板（每孔2 ml），培养24 h后待细胞贴壁，换不含双抗的DMEM培养基培养，待细胞汇合，分为6组（5组实验组，1组对照组）。将P.gingivalis用PBS重悬，紫外可见分光光度计测量浓度，调整至109CFU/ml，当光密度（optical density，OD）值OD660=0.8时，细菌浓度为109CFU/ml［4］，1 000 r/min离心5 min后加入等量不含双抗的DMEM培养基重悬。将含P.gingivalis的DMEM培养基稀释制成不同浓度：109、108、107、106、105CFU/ml，分别加入PDLF中培养6 h，对照组PDLF以等量DMEM培养基培养相同时间［5］，观察细胞形态。

1.4台盼蓝染色法检测细胞活性 参考文献［6］报道，采用台盼蓝染色检测细胞活性。取第3～4代PDLF，胰酶消化，以1×105/ml接种于24孔板中，待细胞汇合，P.gingivalis活菌感染6 h后，PBS冲洗3次，胰酶消化，加等量含10%FBS的DMEM培养基终止消化。取10 μl细胞悬液与10 μl 0.2%台盼蓝染液混合，细胞计数仪计数，计算细胞活率。

1.5实时定量PCR法检测 分别取P.gingivalis活菌体外感染6 h后的PDLF，加入TRIzol裂解细胞，Ex TaqTMⅡ反应体系测定白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、白细胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、RANKL和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-a，TNF-α）的mRNA表达。95℃预变性10 min，95℃、30 s，58℃、1 min，72℃、1 min，共40个循环［7］。实验所用引物见表1，引物由生工生物工程上海有限公司和宝生物工程（大连）有限公司合成，以β-actin为内参，其他各基因产物分别与相应β-actin产物作比较，所得比值为相关基因mRNA的相对水平。

表1　炎性因子和骨代谢基因表达的相关引物序列

1.6统计学处理 采用SPSS 16.0软件对数据进行方差分析，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1P.gingivalis活菌感染PDLF后的细胞形态学观察 接种P.gingivalis活菌6 h后，倒置相差显微镜下观察，细胞形态呈梭形或多角形。当细菌浓度达到109CFU/ml时，肉眼观察可见培养基浑浊，倒置相差显微镜下观察，细胞形态不规则，胞膜不完整，胞核不清晰。见图1。

图1　109CFU/ml P.gingivalis感染PDLF 6 h后于倒置相差显微镜下观察 ×200

2.2台盼蓝染色检测细胞活性 与对照组比较，P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，细胞活率均下降，随着细菌浓度的升高，细胞活率逐渐下降，109、108、107、106、105CFU/ml及对照组的细胞活率分别为（75.5±2.55）%、（76.2±9.98）%、（78.0± 7.77）%、（78.8±4.95）%、（79.9±4.61）%、（91.9 ±6.27）%，但各组间差异无统计学意义（F= 2.595，P＞0.05）。

2.3实时定量qRT-PCR法检测P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后的mRNA表达 采用qRT-PCR法检测P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后IL-6、IL-8、OPG、RANKL、IL-1β、TNF-α的mRNA相对表达情况。qRT-PCR结果显示P.gingivalis活菌浓度从105CFU/ml升高至109CFU/ml，促炎细胞因子IL-6（图2A）、IL-1β（图2B）、TNF-α（图2D）和RANKL（图2E）的mRNA表达呈相对升高趋势。P.gingivalis浓度达到108CFU/ml时，IL-6的mRNA相对表达量与对照组比较差异有统计学意义（F=30.960，P＜0.01），P.gingivalis浓度达到109CFU/ml时，IL-1β、TNF-α的mRNA相对表达量与对照组比较差异有统计学意义（F=11.021、6.537，P＜0.01）。P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后趋化因子IL-8（图2C）的mRNA相对表达量相对升高，当P.gingivalis活菌浓度达到107CFU/ml时，差异有统计学意义（F= 128.297，P＜0.01）。此外，P.gingivalis活菌浓度从105CFU/ml升高至109CFU/ml，RANKL的mRNA表达亦呈升高趋势，于108CFU/ml浓度下相对表达量最高，与对照组比较差异无统计学意义（F= 5.082，P＞0.05）。P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后所有实验组OPG（图2F）的mRNA表达均明显下降，差异有统计学意义（F=39.839，P＜0.01），当P.gingivalis活菌浓度为109CFU/ml时，OPG的mRNA相对表达量最低。

3　讨论

近年来关于P.gingivalis活菌及其各毒力因子感染机体细胞的研究日益增多。作为牙周炎的主要致病菌之一，探讨P.gingivalis活菌对牙周组织细胞的作用对于研究牙周炎的发生、发展至关重要。本实验结果显示P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，细胞活率虽然有所下降，但差异无统计学意义。与P.gingivalis活菌不同，分别用脂多糖或者高温灭活后的P.gingivalis感染牙龈上皮细胞，可诱发程序性细胞死亡，但是含有大量P.gingivalis的牙龈上皮细胞并未发生程序性细胞死亡或者坏死，其原因在于P.gingivalis活菌可通过内源性信号通路抑制牙龈上皮细胞程序性死亡［8］。由此推测，P.gingivalis活菌侵入PDLF中，可抑制细胞程序性死亡，进而逃避宿主免疫防御机制，从而使自身能在宿主细胞内长期存留，引发深层感染。

单纯的牙周致病菌存在并不是导致牙周组织破坏的唯一原因［9］，宿主对菌斑生物膜的免疫炎症反应是导致牙周软硬组织破坏的主要原因［10］。本实验检测了P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和趋化因子IL-8的基因表达。当P.gingivalis活菌浓度达到108CFU/ml和107CFU/ml时，IL-6和IL-8的mRNA相对表达量均升高，差异有统计学意义。由于P.gingivalis脂多糖和P.gingivalis产生的硫化氢气体均可促进牙周膜细胞IL-6、IL-8的mRNA表达，同时二者还能协同促进牙周膜细胞IL-6、IL-8的mRNA表达［11］，故而推测本实验中IL-6、IL-8基因表达的升高可能是P.gingivalis活菌表面的毒力因子（如脂多糖）以及其产生的毒性产物（如硫化氢气体）共同作用的结果。当P.gingivalis活菌浓度达到109CFU/ml时，IL-1β、TNF-α的mRNA表达升高，差异有统计学意义。Kato et al［12］发现P.gingivalis脂多糖可促进牙周膜干细胞IL-6、IL-8、IL-1β的产生。研究［13］表明利用P.gingivalis超声提取物作用肝癌细胞系Hepa-1.6 6 h后，细胞的TNF-α的mRNA亦升高。P.gingivalis属口腔正常菌群，达到一定的数量可成为致病优势菌。本实验结果亦提示炎性因子相对表达量的多少可能与P.gingivalis活菌的浓度有关。

本实验结果显示，P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后，RANKL的mRNA相对表达量虽有升高但差异无统计学意义，而所有实验组OPG的mRNA相对表达量均降低，差异有统计学意义。Scheres et al［5］以108CFU/ml的P.gingivalis活菌攻击PDLF 6 h后，RANKL的mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义。RANKL/OPG是一对与牙槽骨吸收和改建密切相关的细胞因子。RANKL是破骨生成的关键因子，可与核因子κB受体活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）结合，促进破骨细胞的分化、活化和成熟。OPG可作为诱骗受体与RANKL结合竞争性抑制RANKL/RANK信号系统，抑制破骨细胞的分化和活化并促进破骨细胞凋亡，是破骨细胞生成的负相调节因子［14］。由此推测P.gingivalis感染6 h内，PDLF可通过下调OPG的基因表达参与骨代谢的调控。

图2　P.gingivalis活菌感染PDLF 6 h后IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α、RANKL、OPG的mRNA表达A：IL-6 mRNA；B：IL-1β mRNA；C：IL-8 mRNA；D：TNF-α mRNA；E：RANKL mRNA；F：OPG mRNA；与对照组比较：**P＜0.01

综上所述，PDLF可在P.gingivalis感染后产生一系列不同的细胞因子，参与牙周组织的破坏与改建。PDLF在牙周炎的炎性与骨代谢相关的细胞因子产生中具有重要的作用。但是PDLF产生这些细胞因子的具体机制，如何调控其基因表达使其产生更有利于牙周组织修复与改建的细胞因子尚需进一步研究。

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Effects of viable Porphyromonas gingivalis on the viability and gene expression of inflammatory cytokines and bone metabolism of periodontal ligament fibroblasts

Yang Yang，Xu Yan，Meng Mingli，et al
（Stomatologic College of Anhui Medical University，The Affiliated Stomatologic Hospital of Anhui Medical University，Key Lab.of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To study the cell viability and gene expression of inflammatory cytokines and bone metabolism of periodontal ligament fibroblasts（PDLF）upon challenge by viable Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis）. Methods Human PDLF was challenged in vitro by viable P.gingivalis for 6 hours and then the cell viability and gene expression of inflammatory cytokines such as IL-6，IL-8，IL-1β，TNF-α，RANKL，OPG were analyzed.Results No obvious change in cell viability was observed before and after challenged by viable P.gingivalis.The expressions of both IL-6 and IL-8 were strongly induced when the concentration of viable P.gingivalis was 108CFU/ ml and 107CFU/ml.The expression of IL-1β and TNF-α also increased significantly when the concentration of viable P.gingivalis was 109CFU/ml.The expression of OPG was suppressed significantly by P.gingivalisin in PDLF while the gene expression of RANKL remained unchanged.Conclusion When challenged by P.gingivalis，PDLF participates in the regeneration and remodeling of periodontal tissue by producing cytokines.

Porphyromonas gingivalis；periodontal ligament fibroblasts；cytokines；osteoclast

R 780.2

A

1000-1492（2016）06-0786-05

2016-04-01接收

安徽省自然科学基金（编号：1408085MKL28）

1安徽医科大学口腔医学院，安徽医科大学附属口腔医院，安徽省口腔疾病研究中心实验室，合肥 230032

2安徽医科大学人兽共患病安徽省重点实验室，合肥230032

杨 洋，女，硕士研究生；徐 燕，女，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：173236344@qq.com