杨 莹 倪娜娜 王光平 温斯健 宋 昊 崔盘根 孙建方

论 著

CXCL12对人黑素瘤细胞株M14生物学行为的影响

杨 莹 倪娜娜 王光平 温斯健 宋 昊 崔盘根 孙建方

目的： 明确CXCL12对人黑素瘤细胞株M14体外增殖、迁移、侵袭的影响。方法： 用不同浓度的CXCL12（0、10、50、100、200 ng/mL）刺激或诱导人黑素瘤细胞株M14，CCK8法检测细胞增殖，Transwell迁移和侵袭试验检测细胞迁移和侵袭能力。用100 ng/mL的CXCL12处理人黑素瘤细胞株M14，Western blot法检测处理后不同时间点（0、5、10、20、30、60 min）的ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表达。结果： CXCL12能够增强人黑素瘤细胞株M14细胞的体外增殖、迁移、侵袭能力，以及促进ERK、AKT信号通路的激活。结论： CXCL12可能与黑素瘤的进展过程相关。

黑色素瘤； CXCL12； 肿瘤细胞生物学行为

趋化因子CXCL12（C-X-C motif chemokine ligand 12，又名stromal cell derived factor-1，SDF-1）是趋化因子受体 CXCR4（C-X-C chemokine receptor type 4）和CXCR7（C-X-C chemokine receptor type 7）的共同配体，其所构成的CXCL12/CXCR4生物轴及CXCL12/CXCR7生物轴近年来被证实在肿瘤的发生、发展尤其是侵袭转移中发挥重要作用［1］。我们在前期的研究中利用Realtime PCR和Western blot法检测CXCR4和 CXCR7在人黑素瘤细胞株 A375、M14、 MV3的表达，基于试验结果，选择CXCR4和CXCR7表达最高的人黑素瘤细胞株M14作为实验细胞株。因此，本研究以体外培养的人黑素瘤细胞株M14作为主要实验研究对象，观察CXCL12对人黑素瘤细胞株M14细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 兔抗人p-ERK多克隆抗体、鼠抗人ERK单克隆抗体、兔抗人p-AKT多克隆抗体、兔抗人AKT多克隆抗体、鼠抗人Actin单克隆抗体均购自Santa Cruz Biotechnology，重组人 CXCL12/SDF-1α购自R&D Systems，CCK8试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所，Matrigel购自BD Biosciences。细胞：人黑素瘤细胞株M14由本所研究生馈赠，培养在含10% FBS的DMEM培养基中。

1.2 实验方法

1.2.1 CCK8法 实验根据CXCL12的药物浓度（0、10、50、100、200 ng/mL）分为5组，同时设置空白对照组。制备细胞悬液，调整细胞浓度为2.5×103个/mL，每孔100 μL接种于96孔培养板中，细胞贴壁后加入10 μL不同浓度的CXCL12，调整药物终浓度为0、10、50、100、200 ng/mL，第24 h、48 h、72 h分别取出，每孔加入10 μL的CCK8试剂，继续培养1.5 h后，在酶标仪上测定各孔在波长450 nm的OD值，记录结果。每组设置4个复孔，实验重复3次。

1.2.2 Transwell迁移及侵袭试验 实验根据下室加入的CXCL12药物浓度（0、10、50、100、200 ng/mL）分为5组。Transwell迁移与侵袭试验的区别在于Transwell侵袭试验小室使用前上室面需要铺胶，实验使用的Matrigel按1∶8稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，其余步骤相同。细胞撤血清饥饿16 h，制备细胞悬液，调整细胞密度至5×105个/mL，每上室加入200 μL含1%FBS的无血清培养基重悬后的细胞悬液，下室加入500 μL含不同浓度CXCL12（0、10、50、100、200 ng/mL）的10%FBS的培养基，常规培养24 h后，0.1%结晶紫染色，200×高倍镜下随机选取6个视野，拍照计数。实验重复3次。

1.2.3 Western blot法 按总蛋白提取试剂说明书提取人黑素瘤细胞株M14的总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后，每泳道取等量蛋白60 μg上样后电泳，先80 V电压跑上胶30 min，再改用120 V跑下胶90 min，切胶转膜，封闭，分别加入一抗ERK（1∶500）、p-ERK（1∶500）、AKT（1∶500）、p-AKT（1∶500）、β-Actin（1∶500）后4℃过夜，次日室温再孵育 30 min后加入荧光二抗（1∶5000 IRDye800CW donkey anti-Rabbit IgG或 1∶5000 IRDye800CW donkey anti-mouse IgG），使用美国LICOR公司的Odyssey双色红外荧光成像系统显色成像，保存图片。

1.2.4 统计学方法 采用GraphPad Prism6.0版软件进行数据分析，数据以均数±标准差表示，两组以上数据比较采用方差分析后，差异有统计学意义的再用Boneferroni检验对每两组数据进行比较。检验水准均设为α=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCL12对人黑素瘤细胞株M14细胞增殖能力的影响 不同浓度（0、10、50、100、200 ng/mL）的CXCL12作用于人黑素瘤细胞株M14细胞24、48、72 h后，利用CCK8法检测人黑素瘤细胞株M14的细胞增殖能力。结果显示，10、50、100、200 ng/mL浓度的CXCL12均能刺激人黑素瘤细胞株M14的细胞增殖，且随着时间的延长，逐渐出现剂量依赖的现象，即药物浓度越高，促进细胞增殖的能力越强，但第72 h时间点，100 ng/mL与200 ng/mL浓度的组间差异统计学上无明显意义，除图中所标示的组（P＞0.05），其余组间差异均具有统计学意义（图1）。

图1 不同浓度的CXCL12对人黑素瘤细胞株M14细胞增殖能力的影响

2.2 CXCL12对人黑素瘤细胞株M14细胞体外迁移及侵袭能力的影响 利用Transwell迁移及侵袭试验检测不同浓度（0、10、50、100、200 ng/mL）的CXCL12诱导后的人黑素瘤细胞株M14的细胞迁移及侵袭能力（图2、3）。结果显示，10、50、100、200 ng/mL浓度的CXCL12均能诱导人黑素瘤细胞株M14的细胞迁移能力的增强，且随着浓度的增加，诱导细胞迁移的能力越强，但100 ng/mL与200 ng/mL浓度的组间差异无统计学意义（P＞0.05），其余组间的差异具有统计学意义；50、100、200 ng/mL浓度的CXCL12均能诱导人黑素瘤细胞株M14的细胞侵袭能力的增强，且随着浓度的增加，诱导细胞侵袭的能力越强，但10 ng/mL浓度与0 ng/mL浓度的组间差异无统计学意义（P＞0.05），其余组间差异具有统计学意义（图4）。

2.3 CXCL12对人黑素瘤细胞株M14细胞p-ERK、p -AKT表达水平的影响 实验分为6组，基于CCK8法、Transwell迁移及侵袭试验的结果，我们选择以100 ng/mL浓度的CXCL12处理人黑素瘤细胞株M14细胞，利用Western blot法检测处理后不同时间点（0、5、10、20、30、60 min）的ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表达，分别以ERK、AKT的表达量作为对照，计算p-ERK、p-AKT的相对表达量（图5）。结果显示，不同时间点的p-ERK、p-AKT的相对表达量在统计学上有明显差异（P＜0.05）。随着时间的延长，ERK、AKT的磷酸化增加，从而使得相关的ERK、AKT信号通路过度活化，100 ng/mL的CXCL12可以促进ERK、AKT信号通路的活化。但是，p-ERK的相对表达量在处理后20 min和30 min之间的差异无统计学意义，p-AKT的相对表达量在处理后10 min达到最大值，其后一直保持在高水平，与处理后的20 min、30 min、60 min的相对表达量比较，统计学上无明显差异（图6）。

图2 Transwell迁移（×200）

图3 Transwell侵袭（×200）

图4 CXCL12对人黑素瘤细胞株M14细胞体外迁移（4a）及侵袭（4b）能力的影响

图5 利用Western blot法检测处理后不同时间点（0、5、10、20、30、60 min）的 ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表达 图6 CXCL12对人黑素瘤细胞株M14细胞p-ERK（6a）、p-AKT（6b）相对表达水平的影响

3 讨论

黑素瘤（Melanoma，MM）是恶性程度极高的肿瘤，好发于皮肤，一旦发生转移，其5年生存率仅有14%［2］。研究表明，趋化因子受体与黑素瘤的进展转移有密切关系，譬如趋化因子受体CCR7能促进黑素瘤转移至淋巴结，趋化因子受体CCR10可增强黑素瘤细胞侵袭宿主的能力及促进远处转移［3］。

CXCL12是趋化因子受体CXCR4和CXCR7的共同配体，包括SDF-1α和β两种异构体，属于趋化因子CXC亚家族。其所构成的CXCL12/CXCR4生物轴及CXCL12/CXCR7生物轴能促进多种肿瘤的进展，被认为有望成为肿瘤靶向治疗的新途径［1］。ERK、AKT信号通路激活参与多种肿瘤的形成及进展，包括在黑素瘤细胞的增殖、存活、侵袭中发挥重要作用［4］。研究发现，趋化因子及其受体通过激活ERK、AKT信号通路从而发挥作用，如 CXCR4/CXCL12生物轴可激活ERK通路并促进前列腺癌的血管生成［5］，CXCR7/CXCL12生物轴也可激活 ERK、AKT通路增强T细胞的增殖及趋化能力［6］。

目前的研究对趋化因子受体CXCR4、CXCR7在黑素瘤进展中的作用存在不同意见，部分研究认为CXCR4在黑素瘤进展中起重要作用［7-10］，少数研究认为促进黑素瘤进展的是CXCR7而不是CXCR4［11］。虽然存在争议，但是CXCL12作为CXCR4、CXCR7受体的共同配体，其对黑素瘤进展的作用值得我们研究。Mori等［12］研究表明，CXCL12在50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL浓度下均能刺激胰腺癌细胞的迁移与侵袭，但效果最强的浓度是100 ng/ mL。Lechertier等［13］研究表明，CXCL12在10 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL浓度下均能刺激MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移，且随着CXCL12浓度的升高，迁移能力也增强，这种作用受到其受体CXCR4的调节。Yamada等［14］研究显示，CXCL12在100 ng/mL浓度下可增强肿瘤内皮细胞的迁移能力，且可激活ERK信号通路。Lee等［15］研究显示，CXCL12在50 ng/mL、200 ng/mL的浓度下能够诱导正常人表皮黑素细胞的迁移，50 ng/mL浓度的CXCL12即可激活ERK信号通路。

基于以上文献，我们设置了CXCL12的5个浓度（0、10、50、100、200 ng/mL）进行试验分组。研究结果显示，10、50、100、200 ng/mL的CXCL12均能增强人黑素瘤细胞株M14细胞的增殖能力、迁移能力，而50、100、200 ng/mL的CXCL12能增强人黑素瘤细胞株M14细胞的侵袭能力，且随着浓度的增加，其促进细胞增殖、迁移及侵袭的作用更加明显。但是，第72 h时间点时的100 ng/mL与200 ng/mL的CXCL12对细胞增殖的影响组间差异无统计学意义，且100 ng/ mL与200 ng/mL的CXCL12诱导迁移的细胞数量统计学上无显著性差异。而且，我们发现100 ng/mL的CXCL12具有促进ERK、AKT信号通路激活的效果。综合上述试验结果，CXCL12能够增强人黑素瘤细胞株M14细胞的体外增殖、迁移、侵袭能力，以及促进ERK、AKT信号通路的激活，提示CXCL12可能与黑素瘤的进展过程相关，为后续研究CXCL12/CXCR4生物轴、CXCL12/CXCR7生物轴在黑素瘤进展中的作用提供了实验依据。

［1］邱明远，李健文，郑民华.CXCR4和CXCR7在肿瘤中的研究进展［J］.中国癌症杂志，2010，3：222-226.

［2］Miller AJ，Mihm MC.Melanoma［J］.New England Journal of Medicine，2006，355（1）：51-65.

［3］Murakami T，Cardones AR，Hwang ST.Chemokine receptors and melanoma metastasis［J］.J Dermatol Sci，2004，36（2）：71-78.

［4］王丽，栗玉珍.黑素瘤的分子发病机制和靶向治疗新进展［J］.中国皮肤性病学杂志，2012，2：164-166.

［5］Wang J，Wang J，Sun Y，et al.Diverse signaling pathways through the SDF-1/CXCR4 chemokine axis in prostate cancer cell lines leads to altered patterns of cytokine secretion and angiogenesis［J］.Cell Signal，2005，17（12）：1578-1592.

［6］Kumar R，Tripathi V，Ahmad M，et al.CXCR7 mediated Gialpha independent activation of ERK and Akt promotes cell survival and chemotaxis in T cells［J］.Cell Immunol，2012，272（2）：230-241.

［7］Andre ND，Silva VA，Watanabe MA，et al.Knockdown of chemokine receptor CXCR4 gene by RNA interference：Effects on the B16-F10 melanoma growth［J］.Oncol Rep，2016.

［8］Robledo MM，Bartolome RA，Longo N，et al.Expression of functional chemokine receptors CXCR3 and CXCR4 on human melanoma cells［J］.J Biol Chem，2001，276（48）：45098 -45105.

［9］Scala S，Giuliano P，Ascierto PA，et al.Human melanoma metastases express functional CXCR4［J］.Clin Cancer Res，2006，12（8）：2427-2433.

［10］Murakami T，Maki W，Cardones AR，et al.Expression of CXC chemokine receptor-4 enhances the pulmonary metastatic potential of murine B16 melanoma cells［J］.Cancer Res，2002，62（24）：7328-7334.

［11］Liedtke D，Erhard I，Abe K，et al.Xmrk-induced melanoma progression is affected by Sdf1 signals through Cxcr7 ［J］.Pigment Cell Melanoma Res，2014，27（2）：221-233.

［13］Lechertier T，Berard M，Vassy R，et al.Transendothelial migration of two metastatic breast carcinoma cells depend on the SDF-1 alpha-CXCR4 complexes［J］.Anticancer Res，2004，24（6）：4011-4017.

［14］Yamada K，Maishi N，Akiyama K，et al.CXCL12-CXCR7 axis is important for tumor endothelial cell angiogenic property［J］.Int J Cancer，2015，137（12）：2825-2836.

［15］Lee E，Han J，Kim K，et al.CXCR7 mediates SDF1-induced melanocyte migration［J］.Pigment Cell Melanoma Res，2013，26（1）：58-66.

（收稿：2016-03-09 修回：2016-04-11）

Effects of CXCL12 on the biological behavior of human melanoma M14 cell line

YANG Ying，NI Nana，WANG Guangping，WEN Sijian，SONG Hao，CUI Pangen，SUN Jianfang.
Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China
Corresponding author：SUN Jianfang，E-mail：fangmin5758@aliyun.com

Objective：To investigate the effects of CXCL12 on the biological behavior of human melanoma M14 cell line.Methods：The human melanoma M14 cell line was incubated or induced by different concentrations of CXCL12（0，10，50，100，200 ng/mL）.The Cell Counting Kit-8（CCK8），transwell migration and invasion assay were used to evaluate the proliferation，migration，and invasion of M14 cells.The Western blot was used to detect the protein expression of ERK，p-ERK，AKT，and p-AKT of M14 cells treated with 100 ng/mL CXCL12 at different times（0，5，10，20，30，60 min）.Results：CXCL12 promoted the proliferation，migration and invasion of M14 cells，and the activation of the ERK and AKT signaling pathways. Conclusion：CXCL12 may be associated with the progression of melanoma.

melanoma；CXCL12；tumor cell biological behavior

北京协和医学院研究生创新基金

（编号：20141002310023005）

国家自然科学基金面上项目（编号：81171513）

2012高等学校博士学科点专项科研基金

（编号：20121106110040）

中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，南京，210042

孙建方，E-mail：fangmin5758@aliyun.com

［12］Mori T，R，Koizumi M，et al.CXCR4 antagonist inhibits stromal cell-derived factor 1-induced migration and invasion of human pancreatic cancer［J］.Mol Cancer Ther，2004，3（1）：29-37.