罗　昌，陈东亮，程　曦，黄丛林

(北京市农林科学院 北京农业生物技术研究中心，北京100097)



甘菊ClHSP70与ClHSP90基因的克隆及表达分析

罗昌，陈东亮，程曦，黄丛林*

(北京市农林科学院 北京农业生物技术研究中心，北京100097)

该研究以甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium)为实验材料，通过RT-PCR方法从甘菊转录组数据中分离出热激蛋白合成相关基因，命名为ClHSP70和ClHSP90。序列分析表明，ClHSP70基因ORF全长为2 559 bp，编码852个氨基酸，蛋白功能区预测表明含有典型的HSP70蛋白NBD和SBD保守结构域；ClHSP90基因ORF全长为2 094 bp，编码697个氨基酸，含有HATPase结构域和HSP90保守结构域。生物信息学分析表明，甘菊ClHSP70与大豆(Glycinemax)和烟草(Nicotianatomentosiformis)HSP70蛋白有较高的一致性，ClHSP90基因编码的氨基酸序列与紫茎泽兰(Ageratinaadenophora)HSP90高度相似；实时荧光定量表达分析表明，在42 ℃处理不同时间，甘菊叶片中ClHSP70和ClHSP90基因表达均在0.5 h时显著增加，1 h达到最大值，2 h后缓慢下降；不同组织表达分析表明，甘菊在42 ℃处理1 h后，ClHSP70在成熟叶中的表达量显著高于嫩叶和根等其他组织；ClHSP90在成熟茎中的表达量最高。研究说明，ClHSP70和ClHSP90基因具有热激蛋白特征，参与了甘菊热胁迫应答过程，该研究结果为以后深入研究其基因功能奠定了基础。

甘菊;ClHSP70;ClHSP90; 热胁迫

热激蛋白(heat shock protein, HSPs)是在热激条件下被诱导且表达增加的一部分特异蛋白质，在植物应对外界环境压力，如干旱、盐、低温及高温等时起着重要的作用[1]。HSPs的积累与生物耐热性呈正相关，也就是说，在热胁迫下HSPs的积累可以提高植株的耐热性。

HSPs种类存在范围很广，根据其分子量大小，可分为5类：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和‘小HSPs’[2]。在植物热激蛋白家族中，HSP70最为保守和普遍，HSP70在氨基酸序列上高度相似，含有核酸结合区和底物结合区2个功能区，N-末端具有典型的约45 kD的ATPase区域。研究表明，HSP70在热胁迫条件下能够被显著诱导，小球藻HSP70B含量在热胁迫2 h后增加最明显[3]，花生(ArachishypogaeaLinn.)AhHSP70在高温胁迫3 h后表达明显升高[4]。近年来在拟南芥[5]、烟草[1]、玉米[6]等研究中也证明了HSP70与植物耐热性相关。HSP90是一个受ATP调节的二聚体分子伴侣，在分子进化上高度保守，每个单体由ATPase结构域、中间结构域和介导HSP90二聚化的C端结构域组成[7-8]。目前对于植物中HSP90蛋白的研究相对较少，拟南芥[9]和水稻[10]中的研究表明受到热胁迫时HSP90表达量显著增加，HSP90蛋白的积累量明显提高，但其结构和功能仍待进一步探究。另外，有研究证实HSP90在植物生长发育进程中起着至关重要的作用，其功能的缺失会引起植物形态和生理特性发生改变[11-12]。此外，由于热诱导和组成型表达的热激蛋白可定位于细胞的细胞质和多种细胞器中，包括叶绿体、内质网[13-14]等，且执行着不同的功能，也可在不同的器官中被诱导，可在根、茎、叶、种子以及幼苗中产生，因此高温胁迫下植物HSPs基因的表达也呈现出明显的组织特异性。

菊花(Chrysanthemum×morifoliumRamat.)是多年生草本植物，起源于中国，世界上均有广泛栽培，在中国花卉生产中占有重要地位，周年生产鲜花是菊花生产的迫切需求。但是，周年生产过程中菊花在现蕾阶段容易受到夏季高温胁迫，导致花芽早熟或夭折。因此，了解菊花在受到热胁迫时的耐热机制对于培育适合周年生产的菊花品种很有必要。甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium) 为菊科菊属二倍体野生种(2n=2x=18)，是菊花原始种之一，生长于海拔200～2 800 m平原及山坡，有较强抗逆性，其生长季节和开花习性与栽培菊花相似[15-16]。本研究参照甘菊均一化转录组数据库，利用RT-PCR技术，分离得到ClHSP70和ClHSP90的cDNA全长序列，利用实时荧光定量PCR技术分析了2个基因在高温下不同处理时间和不同组织部位中的表达特性，为ClHSP70和ClHSP90基因的功能鉴定以及菊花耐热育种奠定基础。

1　材料与方法

1.1植物材料及处理

从北京农业生物技术研究中心组培室中选取15株生长水平一致的甘菊组培苗为实验材料。将光照培养箱温度设置为42 ℃，每3株作为一个重复，分别处理0、0.5、1、2和4 h时选取上部新鲜叶片置于液氮中冷冻，并放入-80 ℃冰箱中备用；42 ℃处理1 h, 选取植株嫩叶、成熟叶、嫩茎、成熟茎、根置于液氮中冷冻，并放入-80 ℃冰箱中备用。

1.2方法

1.2.1总RNA提取及甘菊ClHSP70和ClHSP90基因克隆用植物RNA小量提取试剂盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa公司)提取甘菊叶片总RNA，再用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)将所提取RNA反转录为cDNA并检测其浓度。

从甘菊均一化转录组数据中筛选ClHSP70和ClHSP90基因序列信息，根据在NCBI网站上预测2个基因的ORF设计引物(表1)。PCR反应体系(50 μL)：2 μL cDNA模板(100 mmol/L)，0.5 μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL)，10 μL 5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)，4 μL dNTP Mixture (各2.5 mmol/L)，正反向引物各2 μL 以及29.5 μL ddH2O。PCR扩增条件为98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，58 ℃复性5 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃延伸6 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的片段后连接到pGEM-T Easy载体上，42 ℃热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行Amp抗性筛选和X-gal/IPTG蓝白斑筛选。挑取白色菌落进行PCR检测，阳性克隆送往上海生物工程有限公司进行测序。用Segman序列拼接软件对测序结果进行拼接，分别获得ClHSP70和ClHSP90的ORF全长序列。

表1　本实验相关引物

1.2.2ClHSP70和ClHSP90基因的生物信息学分析利用NCBI数据库中Blast工具对ClHSP70和ClHSP90基因序列进行比对和同源性分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；运用Finder软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/g orf.html)进行开放阅读框分析；在NCBI Conserved Domain Database (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中进行蛋白质保守结构域预测；通过ExPASy-ProtParam软件(http://web.expasy.org/protparam)预测蛋白的分子量及等电点；SMART在线软件对蛋白质结构域进行分析预测。利用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析蛋白质的信号肽。使用Clustal X软件进行氨基酸序列多重比对[17]，利用MEGA5.0软件构建进化树(Neighbor- Joining)[18]，并进行Boot-strap检测。

1.2.3ClHSP70和ClHSP90基因表达分析用植物RNA小量提取试剂盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa公司)提取42 ℃不同时间(0、0.5、1、2、4 h)处理后的甘菊叶片RNA，已经42 ℃处理1 h后不同组织部位(嫩叶、成熟叶、嫩茎、成熟茎、根)的RNA。用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)将所提取RNA反转录为cDNA。根据ClHSP70和ClHSP90基因的全长序列，用Premier 5.0设计Real-time PCR引物(表1)，采用Actin基因作为内标。参照荧光定量试剂盒SYBR®Premix EX TaqTMⅡ(TilRNaseH Plus，TaKaRa)说明书进行操作：SYBR Premix EX Taq (2×) 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL, cDNA模板 (100 mmol/L) 1 μL, ddH2O 7.8 μL,总体积20 μL。反应程序为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，40个循环后作熔解曲线。每个样品均重复3次，在ABIStep-OnePlusTMReal-time PCR仪(美国ABI公司)上进行，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

2　结果与分析

2.1ClHSP70和ClHSP90基因克隆

根据甘菊转录组数据Unigene blastx注释结果筛选HSP70和HSP90序列，在NCBI中进行开放阅读框分析并设计特异性引物，以甘菊叶片cDNA为模板扩增到ClHSP70和ClHSP90编码框序列，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，2个基因扩增条带长度分别为2 500 bp和2000 bp左右(图 1)，片段经测序后正反向拼接得到基因的全长。分析结果表明，ClHSP70含有1个2 559 bp开放阅读框，编码852个氨基酸(图 2)；ClHSP90含有一个2 094 bp开放阅读框，编码697个氨基酸(图 3)。

2.2ClHSP70和ClHSP90基因生物信息学分析

经Protparatam在线工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析，结果显示(表 2)ClHSP70蛋白的总平均疏水性为-0.444, ClHSP90蛋白的总平均疏水性为-0.604，均为亲水性蛋白；总的带负电荷的氨基酸比重均略高于带正电荷的氨基酸，表现为酸性蛋白；从稳定系数推测ClHSP70为不稳定蛋白，ClHSP90为稳定蛋白。通过二级结构预测发现ClHSP70含有40.73%的α-螺旋，5.87%的β-折叠和36.85%的随机卷曲；ClHSP90则含有51.51%的α-螺旋、6.31%的β-折叠和24.82%的随机卷曲。SignalP在线分析ClHSP70和ClHSP90均不含信号肽序列，也无跨膜结构。

M. DL5000; 1. ClHSP70；2. ClHSP90图1　甘菊ClHSP70和ClHSP90基因扩增结果Fig. 1　PCR amplification results of ClHSP70 and ClHSP90 gene from C. lavandulifolium

下划线部分为N端NBD结构域(A)和N端保守的ATPase结构域(B)；灰色阴影部分为高度保守的ClHSP90氨基酸序列(B)；黑色阴影部分为C-末端胞质亚型特殊信号的基序(B)；*.表示终止密码子图2　甘菊ClHSP70 (A)和ClHSP90 (B)基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列Underline represents NBD domain of N-terminus domain(A)and the ATP binding domain of N-terminus domain (B); shaded gray represents highly conserved amino acid ClHSP90 signature sequence motifs characteristic (B); shaded black represents the C-terminus cytosolic isoform specific signature motif (MEEVD) (B); *. Stop codonFig. 2　The nucleotide and deduced amino acid sequences of ClHSP70 (A) and ClHSP90 (B) in C. lavandulifolium

NtHSP70-15.烟草 (XP009624163.1)；GmHSP70-14.大豆(XP 003546366.1)；AtHSP70. 拟南芥(NP 850984.4)；BoHSP70-14.甘蓝(XP 013591718.1)图3　甘菊ClHSP70与其他物种HSPs多序列比对NtHSP70-15.Nicotiana tomentosiformis (XP 009624163.1)；GmHSP70-14. Glycine max(XP 003546366.1)；AtHSP70. Arabidopsis thaliana (NP 850984.4)；BoHSP70-14. Brassica oleracea var.oleracea (XP 01591718.1).Fig. 3　Multiple alignment of ClHSP70 with HSPs from other plant species

蛋白性质ProteincharacterClHSP70ClHSP90总氨基酸数目Numberofaminoacids/aa852697蛋白分子质量Molecularweight/kD94.179.9理论等电点pI5.104.98蛋白分子式FormulaC4133H6584N1136O1302S34C3544H5649N917O1124S26总带负电荷的残基数Totalnumberofnegativelychargedresidues(Asp+Glu)135138总带正电荷的残基数Totalnumberofpositivelychargedresidues(Arg+Lys)103106脂肪族指数Aliphaticindex78.9182.50不稳定系数Instabilityindex43.08,不稳定Unstable37.55,稳定Stable总平均疏水性Grandaverageofhydropathicity-0.444-0.604

氨基酸序列比对结果显示，甘菊ClHSP70与大豆(Glycinemax)和烟草(Nicotianatomentosiformis) HSP70蛋白有较高的一致性，分别为78%和76%, 其次是与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、甘蓝(Brassicaoleraceavar.oleracea)同为74%(图 3)；甘菊ClHSP90与紫茎泽兰(Ageratinaadenophora)HSP90有显著的一致性，高达93%，其次是与烟草为92%，与番茄(Solanumlycopersicum)、拟南芥一致性分别为91%和90%(图 4)。说明ClHSP70和ClHSP90具有热激蛋白家族高度保守的特征。保守域预测结果(图 5)表明ClHSP70蛋白C端3～691aa为HSP70蛋白家族保守区域，782～818 aa为一段低复杂性区段(low-complexity region，LCR)。N端9～381aa是核酸结合区(nucleotide binding domain, NBD)(图 2,A)，该结合区氨基酸序列高度保守，具有结合并水解ATP的活性中心，它与ATP的结合-水解过程调控着它对多肽的亲和力，34～219aa为底物结合区(substrate binding domain, SBD)。

ClHSP90蛋白质结构中含有N端高度保守的ATPase结构域29～178aa(图 5)，具有ATPase活性，ClHSP90蛋白质184～697aa。另外，ClHSP90氨

NtHSP80-like.烟草 (XP 009594054.1)；AaHSP90.紫茎泽兰 (ABX76302.1); SlHSP90-1.番茄 (NP 001234436.1)；AtHSP81-2.拟南芥 (NP 200414.1)图4　甘菊ClHSP90与其他物种HSPs多序列比对NtHSP80-like. Nicotiana tomentosiformis (XP 009594054.1)；AaHSP90. Ageratina adenophora (ABX76302.1); SlHSP90-1. Solanum lycopersicum (NP 001234436.1)；AtHSP81-2. Arabidopsis thaliana (NP 200414.1)；GmHSP90-2. Glycine max (NP 001236599.1)Fig. 4　Multiple alignment of ClHSP90 with HSPs from other plant species

基酸序列中还包括HSP90家族5个特征标记序列：NKEIFL RELISNSSDALDKIR、LGTIARSGT、MIGQFGVGF YSAYLVA、IKLYVRRVFI、GIVDSEDLPLNIS RE，C端末尾基序为MEEVD，推测该蛋白为细胞质热激蛋白(图 2,B)。

系统进化树分析表明，ClHSP70基因与拟南芥AtHSP70 (NP-850984.4)、甘蓝BoHSP70-14 (XP-013591718.1)的关系较近，处于同一分支(图6，A)。ClHSP90与同为菊科的紫茎泽兰的AaHSP90(ABX76302.1)关系最近，紫茎泽兰HSP90已验证参与胁迫应答，其次是烟草、番茄，与小麦、拟南芥、甘蓝等的HSP90类基因关系较远 (图6,B)。

2.3ClHSP70和ClHSP90基因表达分析

实时荧光定量PCR分析结果表明，甘菊在42 ℃不同时间处理条件下，叶片中ClHSP70和ClHSP90基因表达量均有显著增加，其中ClHSP70和ClHSP90在处理0.5 h时表达量都开始明显升高，分别为对照的5.8和5.1倍，1 h时表达量达到最高，分别为对照的12.2和9.7倍，2和4 h后ClHSP70和ClHSP90基因表达量有所下降(图7)。说明ClHSP70和ClHSP90属于热诱导型表达的热激蛋白，当甘菊受到高温胁迫时，在很短时间内就能够参与热胁迫响应进行大量表达，增加植株体内HSPs的积累，增强植株的耐热性。

根据ClHSP70和ClHSP90高温处理不同时间的表达情况，将甘菊植株42 ℃处理1 h, 分别取植株的嫩叶、成熟叶、嫩茎、成熟茎、根提取RNA，实时荧光定量PCR分析结果表明，ClHSP70基因在成熟叶中的表达量显著高于其他部位，其次是嫩叶、根、成熟茎、嫩茎。ClHSP90基因在成熟茎中的表达量显著高于其他部位，嫩茎中表达最低，嫩叶、成熟叶、根之间的表达差异不明显(图7)。说明在高温诱导下ClHSP70和ClHSP90的表达存在明显的组织器官特异性，同时ClHSP70与ClHSP90之间表达水平最高的部位也不相同，推测上述2类热激蛋白在植株中的定位和执行功能有所不同。

图5　甘菊ClHSP70和ClHSP90保守域分析结果Fig. 5　Prediction of conserver domain of ClHSP70 and ClHSP90 from C. lavandulifolium

节点数字表示Bootstrap验证中基于1 000次重复的可信度；括号内编号为氨基酸登录号图6　热激蛋白HSP70(A)和HSP90(B)基因编码的氨基酸系统进化树Bootstrap values are shown at nodes based on 1 000 replications; The accession No. is given in bracketsFig. 6　Phylogenetic tree for HSP70 (A) and HSP90 (B) based on alignment of amino acid sequences from other species

不同小写字母表示同一基因不同处理时间和在不同组织中的差异显著，P<0.05图7　甘菊叶片中ClHSP70和ClHSP90 42 ℃高温处理不同时间和在不同组织中的表达Different letters represent significant difference among different treatment times and different tissues under 42 ℃ (P<0.05)Fig. 7　Relative expression level of ClHSP70 and ClHSP90 gene in different treatment times and different tissues under 42 ℃ high temperature stress.

3　讨　论

高温是植物生命活动中常会遭遇的非生物逆境，热激蛋白(HSPs)是细胞受到高温环境或其他胁迫环境诱导时产生的一类功能型蛋白质，可以作为分子伴侣参与细胞内新合成蛋白质的折叠、加工、转运以及蛋白质变性后的复性[19]，增强细胞对胁迫环境的忍耐力从而提高细胞的适应能力[20]。菊花是中国十大名花，世界四大切花(菊花、月季、康乃馨、唐菖蒲)之一，产量居首，随着国内菊花市场规模的发展，其栽培面积在不断扩大，但夏季高温影响了其产量和品质。因此，研究热激蛋白HSPs基因的结构和功能，对于提高菊花耐热性，培育耐高温品种有长远意义。

本研究利用甘菊均一化转录组数据，从甘菊叶片中克隆得到ClHSP70和ClHSP90基因，本实验中保守区预测分析表明，ClHSP70含有典型的NBD结构域和SBD结构域，其在HSP70与ATP结合-水解和发挥分子伴侣功能时起着重要作用。据报道，HSP90多肽N端结构域包含1个ATP结合区域，在HSP90执行生物功能时起着重要作用，真核生物细胞质HSP90的C端含有保守的MEEVD基序[21]，能够与TPR(tetratricopeptide repeat)结构域的蛋白识别并结合，从而使HSP90发挥不同的作用。本研究中ClHSP90 N端结构域包含ATPase结合位点，C端含有MEEVD基序，与莴苣[22]、番茄[23]和拟南芥[24]中的研究一致，是细胞质HSP90。氨基酸序列比对分析表明：ClHSP70与大豆和烟草HSP70蛋白有较高的同源性，ClHSP90与紫茎泽兰、烟草、番茄等植物HSP90有着很高的同源性。从系统进化树可以得出，ClHSP70与拟南芥、甘蓝HSP70聚成一类，ClHSP90与同属于菊科植物的紫茎泽兰聚为一组，并与烟草、番茄HSP90聚成一大分支。因此，ClHSP70和ClHSP90分别属于植物HSP70基因家族和HSP90基因家族成员。

高温胁迫下，热激蛋白受到诱导且表达量明显增加，同时在正常的环境下为维持细胞的正常运转HSP70和HSP90可以组成型表达。本研究中，ClHSP70和ClHSP90在25 ℃时均有表达，且表达相对稳定。研究表明，多数HSPs在受高温胁迫后短时间内就能诱导合成，热激处理3～5 min内，HSPs mRNA的量增加，20 min时可检测到新合成的HSPs, 随着热激时间的延长，HSP的合成能够持续数小时。本研究中，甘菊ClHSP70和ClHSP90在42 ℃处理时其合成主要在1 h内完成并达到最高，2 h后开始下降，4 h急剧下降。这与拟南芥中HSP70家族[25]和莴苣LsHsp90[22]在受到热激处理时的表达模式类似。随着热激时间增加相对表达量下降的原因可能是因为热激基因的长时间表达对生物体不利，植物适应高温环境后将其表达下调[26]。根据亚细胞定位，植物HSP70主要分为四大类，分别为位于细胞质HSP70、内质网HSP70、线粒体HSP70和叶绿体HSP70。HSP90主要定位于细胞质，也有少部分存在于内质网、线粒体和叶绿体等亚细胞中。研究表明，HSPs在热胁迫下的表达与其定位以及执行的功能有一定关系，即高温胁迫下植物HSPs基因的表达有明显的组织器官特异性。本实验中，42 ℃热胁迫1 h，ClHSP70和ClHSP90在植株各个部位均有表达，但表达量具有显著差异性。其中ClHSP70在成熟叶中的表达量最高，与腊梅E-CpHSP70-1基因[27]、玉米热激蛋白70[28]在各个组织器官中的表达分析一致，推测可能与其亚细胞定位主要分布在叶片中有关，相对于嫩叶和其他组织部位，成熟叶细胞中叶绿体、内质网等细胞器含量更多。另外，当植株受到高温胁迫时，首先会引起叶片萎蔫、叶色失绿等表型特征，ClHSP70在成熟叶片中的高表达表明其在植物响应高温胁迫和缓解植物体受到的热损伤过程中起重要作用。ClHSP90在成熟茎中的表达量最高，在叶片中表达量较低，与刘云飞等在番茄中的研究结果类似[23]，说明HSP90在植株受到热胁迫后能在多个组织部位参与植物高温胁迫的应答。此外，HSP90除了参与高温胁迫的应答之外，其在植物生长发育进程中起着至关重要的作用，模式植物拟南芥[29-31]中的研究表明HSP90广泛参与了植物的生长发育过程。本实验中ClHSP90在成熟茎和嫩茎中的表达差异最为明显，推测该基因可能参与茎尖分生组织相关调控活动。甘菊热激蛋白基因对高温胁迫的表达模式研究为菊花耐热性研究提供了分子基础，并为利用基因工程提高菊花耐热性和耐热种质资源创新与应用提供理论依据。关于ClHSP70和ClHSP90在菊花中如何行使其功能我们今后将做进一步研究。

[1]CHO E K, CHOI Y J. A nuclear-localized HSP70 confers thermoprotective activity and drought-stress tolerance on plants[J].BiotechnolLett, 2009, 31(4):597-606．

[2]GUPTA S C, SHARMA A, MISHRA M. Heat shock proteins in toxicology: how close and how far[J].LifeSci, 2010, 86(11-12):377-384．

[3]CHANKOVA S, MITROVSKA Z, MITEVA D. Heat shock protein HSP70B as a marker for genotype resistance to environmental stress in Chlorella species from contrasting habitats[J].Gene, 2013, 516(1):184-189．

[4]SANGSTER T A, QUEITSCH C. The HSP90 chaperone complex, an emerging force in plant development and phenotypic plasticity[J].CurrOpinPlantBiol, 2005, 8(1):86-92．

[5]DONG Y S, GUY C L. Physiological and molecular assessment of altered expression of HSP70-1 inArabidopsis. Evidence for pleiotropic，consequences[J].PlantPhysiology, 2003, 132(2):979-987．

[6]HU X, LIU R, LI Y. Heat shock protein 70 regulates the abscisic acid-induced antioxidant response of maize to combined drought and heat stress[J].PlantGrowthRegulation, 2010, 60(3):225-235．

[7]YOUNG J C, MOAREFI I, HARTL F U. HSP90: a specialized but essential protein-folding tool[J].JournalofCellBiology, 2001, 154(2):267-273．

[8]TERASAWA K, MINAMI M, MINAMI Y. Constantly updated knowledge of Hsp90[J].JournalofBiochemistry, 2005, 137(4):443-447．

[9]YABE N, TAKAHASHI T, KOMEDA Y. Analysis of tissue-specific expression ofArabidopsisthalianaHSP90-family gene HSP81[J].PlantCellPhysiol., 1994, 35(8):1 207-1 219.

[10]LIU D, ZHANG X, CHENG Y. rHSP90 gene expression in response to several environmental stresses in rice (OryzasativaL.)[J].PlantPhysiol.Biochem., 2006, 44(5-6):380-386．

[11]PICARD D. Heat-shock protein 90, a chaperone for folding and regulation[J].Cellular&MolecularLifeSciencesCmls, 2002, 59(10):1 640-1 648．

[12]JACKSON S E, QUEITSCH C, TOFT D. HSP90: from structure to phenotype[J].NatureStructural&MolecularBiology, 2004, 11(12):1 152-1 155．

[13]HAQ N U, RAZA S, LUTHE D S. A dual role for the chloroplast small heat shock protein ofChenopodiumalbum including protection from both heat and metal stress[J].PlantMolecularBiologyReporter, 2012, 31(2):398-408．

[14]SIDDIQUE M, GERNHARD S, KOSKULL-DÖRING P V. The plant sHSP superfamily: five new members inArabidopsisthalianawith unexpected properties[J].CellStress&Chaperones, 2007, 13(2):183-197．

[15]DAI S L, WANG W K, LI M X. Phylogenetic relationship of dendranthema (DC.) Des Moul. revealed by fluorescentinsituhybridization[J].JournalofIntegrativePlantBiology, 2005, 47(7):783-791．

[16]WANG W, DAI S, LI M. Physical mapping of rDNA inDendranthemanankingense and its close related species by fluorescent in situ hybridization[J].Cellular&MolecularBiologyLetters, 2002, 7(3):911-917．

[17]CHENNA R, SUGAWARA H, KOIKE T. Multiple sequence alignment with the clustal series of programs[J].NucleicAcidsRes, 2003, 31(13):3 497-3 500．

[18]TAMURA K, PETERSON D, PETERSON N. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J].Mol.Biol.Evol., 2011, 28(10):2 731-2 739．

[19]HORWITZ J. Alpha-crystallin can function as a molecular chaperone[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 1992, 89(21):10 449-10 453．

[20]BALLINGER D G, PARDUE M L. The control of protein synthesis during heat shock in drosophila cells involves altered polypeptide elongation rates[J].Cell, 1983, 33(33):103-113．

[21]PRODROMOU C, ROE S M, O'BRIEN R. Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the HSP90 molecular chaperone[J].Cell, 1997, 90(90):65-75．

[22]任月，韩莹琰，李婷，等。叶用莴苣热激蛋白90(LsHSP90)基因的克隆及其在热激下的表达[J]. 中国农业科学, 2013, 46(16):3 514-3 522.

REN Y, HAN Y Y, LI T,etal. Molecular cloning and expression analysis of heat-shock-protein90 (LsHSP90) gene from leaf lettuce (LactucasativaL.) under heat shock[J].ScientiaAgriculturaSinica, 2013, 46(16):3 514-3 522.

[23]刘云飞, 万红建, 杨悦俭,等。番茄热激蛋白90的全基因组鉴定及分析[J]. 遗传,2014，36(10):1 043-1 052.

LIU Y F, WAN H J, YANG Y J,etal. Genome-wide identification and analysis of heat shock protein 90 in tomato[J].Hereditas(Beijing), 2014，36(10):1 043-1 052.

[24]MINAMI Y, KIMURA Y, KAWASAKI H. The carboxy-terminal region of mammalian HSP90 is required for its dimerization and functioninvivo[J].Molecular&CellularBiology, 1994, 14(2):1 459-1 464．

[25]SUNG D Y, VIERLING E, GUY C L. Comprehensive expression profile analysis of theArabidopsisHSP70 gene family[J].PlantPhysiol., 2001, 126(2):789-800．

[26]KREBS R A, HOLBROOK S H. Reduced enzyme activity following HSP70 overexpression in drosophila melanogaster[J].BiochemicalGenetics, 2001, 39(1-2):73-82．

[27]阮文进, 门维婷, 马婧,等。蜡梅热激蛋白基因CpHSP70-1的克隆、亚细胞定位与表达分析[J]. 西南大学学报(自然科学版),2016, 38(1):43-52.

TIEN V N, MEN W T, MA J,etal. Cloning, subcellular localization and expression analysis of heat shock protein geneCpHSP70-1 fromChimonanthuspraecox(L.)[J].JournalofSouthwestUniversity(Natural Science Edition), 2016，38(1):43-52.

[28]李慧聪,郭秀林,王冬梅,等。玉米热激蛋白70基因对温度胁迫的响应[J]. 河北农业大学学报, 2010, 33(6):12-15.

LI H C, GUO X L, WANG D M,etal. Responses ofHSP70 gene expression to temperature stresses in maize (ZeamaysL.)[J].JournalofAgriculturalUniversityofHebei, 2010, 33(6):12-15.

[29]QUEITSCH C, SANGSTER T A, LINDQUIST S. HSP90 as a capacitor phenotypic variation[J].Nature, 2002, 417(6 889): 618-624．

[30]SANGSTER T A, BAHRAMI A, WILCZEK A. Phenotypic diversity and altered environmental plasticity inArabidopsisthalianawith reduced HSP90 levels[J].PlosOne, 2007, 2(7):e648．

[31]PRASINOS C, KRAMPIS K, SAMAKOVLI D. Tight regulation of expression of twoArabidopsiscytosolicHSP90 genes during embryo development[J].JournalofExperimentalBotany, 2005, 56(412):633-644．

(编辑:宋亚珍)

Cloning and Expression ofClHSP70 andClHSP90 Gene fromChrysanthemumlavandulifolium

LUO Chang, CHEN Dongliang, CHENG Xi, HUANG Conglin*

(Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing Agricultural Biotechnology Research Center, Beijing 100097, China)

Based onChrysanthemumlavandulifoliumRNA-seq data, we obtained two code DNA sequences namedClHSP70 andClHSP90 using RT-PCR. Sequence analysis showed the predicted open reading frame (ORF) ofClHSP70 is 2 559 bp, encoding a protein of 852 amino acids. The conserver domain search exhibited that N-teminar contains typical NBD domain which belongs to HSP70 family. The predicted ORF ofClHSP90 is 2 094 bp, encoding a protein of 697 amino acids. The conserver domain search showed that N-teminar contains ATPase-superfamily and HSP90 superfamily conservative structure. Bioinformatics showed that the amino acid sequences of ClHSP70 had high consistency withGlycinemaxandNicotianatomentosiformisHSP70, while ClHSP90 had high consistency withAgeratinaadenophoraHSP90. Real-time PCR demonstrated the expression patterns ofClHSP70 andClHSP90 in leaves at 42 ℃. The expression of these two genes were both significantly up-regulated after 0.5 h, reached the highest level after 1 h. Then the expression of both two genes decreased after 2 h, and remained at a relatively lower level after 4 h. In different plant tissues (root, stem, leaf) after 1 h at 42 ℃,ClHSP70 was highly expressed in mature leaves, lower in young, leaves, root, mature stems, young stems, andClHSP90 was the highest in mature stems. The results showed thatClHSP70 andClHSP90 participated the process of heat tolerance inChrysanthemumlavandulifoliumand laid a foundation for analyzingClHSP70 andClHSP90 gene function.

Chrysanthemumlavandulifolium;ClHSP70;ClHSP90; heat stress

1000-4025(2016)07-1321-10

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1321

2016-03-28;修改稿收到日期:2016-05-17

北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX20140109)

罗昌(1982-)，男，硕士，助理研究员，主要从事菊花遗传育种研究。E-mail: changluo1983@126.com.

黄丛林，研究员，主要从事菊花遗传育种研究。E-mail: conglinh@126.com

Q785;Q786

A