高灿红，董丽丽，关晓弯，赵良侠，林俊城，徐福乐，张水明*

(1 安徽农业大学，合肥 230036；2 福州超大现代农业发展有限公司，福州 350003)



青花菜萝卜硫素合成相关基因BoCYP83A1的克隆与表达分析

高灿红1，董丽丽1，关晓弯1，赵良侠1，林俊城2，徐福乐2，张水明1*

(1 安徽农业大学，合肥 230036；2 福州超大现代农业发展有限公司，福州 350003)

CYP83A1基因是萝卜硫素合成代谢中的关键基因，该试验以青花菜品种CDBY-10为材料，利用RACE和RT-PCR方法，获得BoCYP83A1基因的全长序列。该基因全长1 509 bp，编码502个氨基酸，包含保守的P450结构域。通过实时荧光定量PCR分析了BoCYP83A1基因在不同品种、不同组织以及不同激素处理下的表达水平。系统进化树分析表明，BoCYP83A1与结球甘蓝亲缘关系最近。BoCYP83A1基因在不同品种间的组织特异性不同：在青花菜品种CDBY-10的根、茎、叶3个组织间表达水平差异较小，在品种CDBY-12中表现为茎>叶>根，在CDBY-14中则表现为根>茎>叶。MeJA及SA处理均能够引起BoCYP83A1基因表达量的变化：经MeJA处理后，BoCYP83A1基因表达量升高至对照的1.9倍，而后有少量下降；经SA处理后，BoCYP83A1基因表达水平迅速降低，在6 h时降低至对照的0.1倍，而后逐渐回升至对照的表达水平。研究表明，BoCYP83A1基因在不同青花菜品种中的表达特性不同，其表达能够被MeJA和SA所调控。青花菜BoCYP83A1的克隆及鉴定为培育高萝卜硫素含量的青花菜新品种奠定了理论基础。

青花菜; 萝卜硫素;BoCYP83A1; 茉莉酸甲酯；水杨酸

青花菜 (Brassicaoleracea. var.italicaPlanch)营养丰富且具有保健效果，是发达国家进口量最大的蔬菜之一，被誉为“蔬菜皇冠”[1]。青花菜最具特色的是富含功能成分——萝卜硫素 (Sulforaphane, SF)，该成分具有极强的促进致癌物解毒、抑制癌细胞生长的功效，在癌症前期、中期、扩散期均能发挥作用，是迄今为止在蔬菜中发现的抗癌活性最强的天然活性成分[2-3]。随着分子生物学的发展，利用基因工程手段提高萝卜硫素的含量成为青花菜育种的新方向。

萝卜硫素于1992年在青花菜中被发现[4]，是由脂肪族硫苷(Aliphatic glucosinolates)4-甲基亚磺酰丁基硫苷 (Glucoraphanin，RAA)降解生成的一种异硫氰酸盐。研究表明，萝卜硫素的合成代谢途径较为复杂，主要分5个阶段完成。首先合成前端产物甲硫氨酸，随后以甲硫氨酸为起始底物，经过侧链的延伸、硫苷核心结构的形成和侧链的二次修饰等3个阶段形成RAA。最后，RAA在黑芥子酶作用下分解成萝卜硫素[5-7]。此生物过程涉及HMT、MAM、CYP79/CYP83、AOP等多个合成基因家族[6]。如BoHMT处于萝卜硫素合成代谢途径的最前端，对甲硫氨酸的含量水平起关键调控作用[5];MAM1是MAM基因家族中控制底物甲硫氨酸侧链延伸，形成短链硫苷初产物的基因[5]；CYP79/CYP83基因家族是硫苷核心结构形成的关键基因，其中CYP79F1催化合成长链硫苷[6]，CYP83A1则调控硫苷向脂肪类硫苷合成；硫苷侧链二次修饰过程中主要受AOP基因家族调控，其中AOP2和AOP3分别催化形成烯烃基硫苷和羟烷基硫苷[7]。CYP83A1基因是细胞色素氧化酶P450基因家族之一[8]，目前在拟南芥[9-11]、油菜[12]、小白菜[13]、西兰花[14]等多种植物中被鉴定。将拟南芥中CYP83A1基因在白菜中过量表达，白菜中脂肪族芥子油苷和总芥子油苷含量分别增加4.5和2倍[15]。西兰花CYP83A1基因在拟南芥中过量表达，转基因植株中脂肪族芥子油苷4MSOB和4MTB均有明显上升，且脂肪族芥子油苷总量升高[14]。将荠菜中的BjuCYP83A1-1在拟南芥中过表达引起了脂肪族芥子油苷的积累，总叶片芥子油苷增加1.41～1.78倍, 转基因植株中脂肪族芥子油苷增加1.53～1.96倍[16]。综合上述研究，CYP83A1基因的过量表达能够引起脂肪族芥子油苷或总芥子油苷含量的增加，而萝卜硫素的形成以脂肪族芥子油苷的分解为前提，因此脂肪族芥子油苷含量的提高可能直接引起萝卜硫素含量的升高。

本研究利用RACE方法从青花菜中克隆了BoCYP83A1基因的全长序列，并分析了BoCYP83A1在不同品种、不同组织间及MeJA和SA激素处理条件下的表达特性。该研究不但为进一步研究BoCYP83A1的分子生物学功能奠定基础，也为高含量萝卜硫素的新品种培育提供了基因专利。

1　材料与方法

1.1试验材料

选3个萝卜硫素含量不同的青花菜品种CDBY-10、CDBY-12和CDBY-14为试验材料，开展青花菜不同品种、不同组织间基因表达差异的研究。将3个品种播于标准128孔穴盘中，每个品种10株，3次重复。正常育苗管理至3叶1心时取样。分别将同一重复的10株分根、茎、叶3种器官取样，迅速用液氮速冻后转入-80 ℃冰箱储藏备用。

以CDBY-12为试验材料，开展外源激素调控下基因的表达差异研究。采用纸培法将CDBY-12播种于发芽盒 (10 cm×10 cm)中，用5 mL蒸馏水将滤纸湿润，然后有序播种100粒以保证株行距一致，每个处理播种3个重复。待发芽5 d时，分别用1 mmol/L MeJA和3 mmol/L SA喷施处理，以喷施蒸馏水的处理为对照，喷施量控制一致。喷施处理后3、6 和9 h各取样1次，迅速浸入液氮速冻，后转入-80 ℃备用。

1.2方法

1.2.1基因全长序列的克隆采用Trizol法抽提青花菜叶片的总RNA，并使用SMARTTMRACE cDNA Amplication Kit (Clontech)进行反转录获得cDNA。根据NCBI上已登录的拟南芥、油菜、萝卜等物种的CYP83A1序列设计引物83-PF和83-PR，进行扩增以获得中间片段。根据获得的序列设计3’正向引物F3′1、F3′2和反向引物R5′1、R5′2，随后与锚定引物UPM、NUP进行5′和3′末端的扩增。将三部分进行拼接得到基因的全长序列。设计全长引物83HS-F和83HS-R，利用高保真酶Primer STAR HS进行PCR扩增反应，以对拼接的全长序列进行校正。

1.2.2基因生物信息学分析及系统进化树的构建利用DNAMAN 2.6进行不同物种间蛋白序列的比对；采用邻接法在MEGA中构建系统发育树，设置Bootstrap 重复分析500次。利用SignalP进行信号肽预测，利用PDB进行Pfam domain和Motif预测。

1.2.3基因表达分析采用TRzol®(Invitrogen)法抽提样品的总RNA，并使用DNase Ⅰ(TaKaRa)将残余的DNA消化处理，随后取2 μg RNA使用PrimeScript®RT reagent kit (Takara)进行反转录。根据已获得的BoCYP83A1基因全长设计引物83RT-F和83RT-R，以18S为内参基因，按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ (Takara)试剂盒的具体操作步骤在ABI 7500荧光定量仪上进行扩增，相对表达量的计算使用2-ΔΔCT方法。组织特异性表达分析以叶片中的表达量为对照，不同激素处理中以CK的表达量作为对照。

表1　本试验相关的引物序列

数据采用Excel 2003、DPS 7.05、Agilent 1100 offline studio软件进行统计分析。

2　结果与分析

2.1青花菜BoCYP83A1基因cDNA全长的克隆

以83-PF/83-PR为引物进行PCR扩增，获得BoCYP83A1的中间片段 (图1，A)。使用F3′1/UPM、R5′1/ UPM引物进行第一轮的PCR扩增反应，以反应产物作为模板，分别用F3′2/NUP、R5′2/NUP引物进行第二轮的PCR扩增反应，获得750 bp左右的3′片段 (图1，C)和260 bp左右的5′片段 (图,1，B)。将三部分进行拼接得到1 630 bp全长序列。随后以83HS-F/83HS-R为引物，使用高保真酶进行扩增，以对拼接的全长序列进行校正，以此确定青花菜中CYP83A1的全长cDNA序列(图1，D)。利用NCBI的ORF Finder进行分析，青花菜CYP83A1基因全长序列1 509 bp，编码502个氨基酸 (图2)，命名为BoCYP83A1。

2.2BoCYP83A1基因的序列及进化树分析

将BoCYP83A1基因编码的氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列进行比对，发现BoCYP83A1与油菜BnCYP83A1的相似性最高，达到97.01%。与拟南芥AtCYP83A1、萝卜RsCYP83A1相似性分别为87.67%和96.02%。

利用ESyPred3D在线预测BoCYP83A1蛋白质三维结构，其高级结构具有H键306个，螺旋数20个，转角数44个，蛋白质分子量为57.52 kD，等电点7.96。通过SignalP-NN预测该蛋白在第25～26个氨基酸的位置具有1个信号肽结构。通过Pfam数据库比对分析，BoCYP83A1蛋白确实为P450家族基因，结构域跨度为第31～494氨基酸，且第4～21氨基酸序列为1个跨膜相关结构(图2)。

M.DL2000；A. 中间片段产物；B. 5’-RACE 产物；C. 3’- RACE产物；D. 全长cDNA图1　BoCYP83A1基因的扩增结果M. DL2000；A. Internal fragment；B. 5’- RACE fragment；C. 3’ -RACE fragment, D. The full-length cDNAFig. 1　PCR amplification results of BoCYP83A1

为了确定BoCYP83A1与其他物种CYP83A1的亲缘关系，利用MEGA 5.05软件，将BoCYP83A1与已克隆的拟南芥、油菜、萝卜、甘蓝、芥菜和亚麻荠等6个物种的CYP83A1s进行多重序列比对和系统进化分析。结果显示，BoCYP83A1和甘蓝BoCYP83A1(2)的亲缘关系最近，聚为一枝，而与拟南芥AtCYP83A1和亚麻荠CsCYP83A1亲缘关系较远(图3)。

2.3BoCYP83A1基因在不同品种不同组织间的表达差异

分析青花菜BoCYP83A1基因在不同品种的根、茎、叶组织中的表达水平，结果如图4所示。其中，BoCYP83A1基因在CDBY-10的3个组织间表达水平差异较小，在CDBY-12中表现为茎>叶>根，而在CDBY-14中则表现为根>茎>叶。在根系中，CDBY-14BoCYP83A1基因的表达量显著高于其它品种。在茎中，CDBY-14BoCYP83A1基因的表达水平也相对其他品种较高，但相差较小；而在叶片中，CDBY-10BoCYP83A1基因的表达量高于CDBY-14和CDBY-12。

2.4激素诱导下BoCYP83A1基因的表达差异

对不同激素不同时间处理后，BoCYP83A1基因表达量进行检测发现：经MeJA处理3 h时，BoCYP83A1基因表达量升高至对照的1.9倍；随着时间的推移，BoCYP83A1基因表达水平在6 和9 h时有少量下降，但仍高于对照。经SA处理3 h时，BoCYP83A1基因表达水平降低，且在6 h时达到最低，为对照的0.1倍，而9 h时有所回升，且略高于CK的表达水平(图5)。

不同物种的CYP83A1蛋白登录号如下：BoCYP83A1(2). 甘蓝 (XP_013636864); BnCYP83A1. 油菜 (NP_001303017); RsCYP83A1. 萝卜(AHB11194.1); BjCYP83A1. 荠菜 (AGO37757); AtCYP83A1. 拟南芥 ( NP_193113)CsCYP83A1. 亚麻荠 (XP_010495830)图3　不同物种CYP83A1s的系统进化分析CYP83A1 protein accession numbers for different species are as follows: BoCYP83A1(2). Brassica oleracea var. oleracea (XP_013636864); BnCYP83A1. Brassica napus (NP_001303017); RsCYP83A1. Raphanus sativus (AHB11194.1); BjCYP83A1. Brassica juncea (AGO37757); AtCYP83A1. Arabidopsis thaliana( NP_193113)CsCYP83A1. Camelina sativa (XP_010495830)Fig. 3　Phylogenetic analysis among different CYP83A1s

不同小写字母表示不同品种青花菜幼苗组织间基因表达量在0.05水平差异显著性图4　不同品种青花菜幼苗组织间BoCYP83A1基因表达差异Normal letters indicate significant difference of BoCYP83A1 expression among different cultivars or tissues of broccoli at 0.05 levelFig. 4　Expression differences of BoCYP83A1 gene among different tissues or cultivars of broccoli

3　讨　论

本研究从青花菜中克隆了CYP83A1的同源基因，序列中包含保守的P450功能域结构，因此命名为BoCYP83A1 (登录号KU573063)。系统进化树分析显示：BoCYP83A1与其他物种的CYP83A1起源相同，确实是CYP83A1家族的同源基因，但在后来进化的不同时期，与其他物种分离开来。BoCYP83A1与结球甘蓝BoCYP83A1(2)的亲缘关系最近，聚为一枝，而与拟南芥AtCYP83A1和亚麻荠CsCYP83A1亲缘关系较远。

不同小写字母表示不同激素不同处理时间在0.05水平的差异显著性图5　不同激素不同时间处理下BoCYP83A1基因表达差异Normal letters indicate significant difference anomg treat ments with different hormones and times at 0.05 levelFig. 5　Expression differences of BoCYP83A1 gene of broccoli treated with different hormones and times

选取3个青花菜品种CDBY-10、CDBY-12和CDBY-14，对其不同组织中的BoCYP83A1表达量进行检测。CDBY-14中BoCYP83A1的表达水平明显高于CDBY-10和CDBY-12。不同品种中BoCYP83A1的组织特异性表达并不相同：BoCYP83A1在CDBY-10 3个组织间表达水平差异较小，在CDBY-12中表现为茎>叶>根，而在CDBY-14中则表现为根>茎>叶。说明不同品种中萝卜硫素的合成及分布可能并不相同。研究发现,荠菜BjuCYP83A1-1、BjuCYP83A1-2、BjuCYP83A1-3和BjuCYP83A1-4等4个基因的表达均表现出茎>叶>根的趋势[16]；芜菁中CYP83A1的表达特性为叶>根>叶柄[13]。这与BoCYP83A1在青花菜CDBY-12的表达相似。

CYP83A1基因的表达能受外源激素所调控，如荠菜，在MeJA诱导下，除BjuCYP83A1-1表达变化不显著，BjuCYP83A1-2、BjuCYP83A1-3和BjuCYP83A1-4表达均明显上调；在SA诱导下，BjuCYP83A1-1、BjuCYP83A1-2、BjuCYP83A1-3和BjuCYP83A1-4等4个基因的表达均明显下调[16]。本研究结果发现，MeJA喷施3 h后，青花菜BoCYP83A1表达水平显著提高，6～9 h时表达量有所下降，但仍稍高于对照。SA喷施3 h后，BoCYP83A1表达水平显著降低，在6 h时降低为对照的0.1倍，9 h则回升至对照水平。由此推测MeJA和SA也能够调控青花菜BoCYP83A1的表达。

综上所述，青花菜BoCYP83A1基因的表达与调控具有一定的保守性。后续研究将对BoCYP83A1基因的分子生物学功能进行详细解析，从而为培育高萝卜硫素含量的青花菜新品种提供理论依据和基因资源。

[1]张和义. 青花菜优质高产栽培技术[M]. 北京: 金盾出版社, 2007:1-7.

[2]林俊城,吴秋云,高灿红,等.青花菜硫、硒代谢竞争及其对保健功能的影响研究进展[J]. 中国细胞生物学学报, 2011, 33(4):422-432.

LIN J C, WU Q Y, GAO C H,etal. The competition of sulfur and selinium and their effection on health care function in broccoli: a review[J].ChineseJournalofCellBiology, 2011, 33(4): 422-432 .

[3]MOHAMED A F, AMIRA A M. Sulforaphane composition, cytotoxic and antioxidant activity of crucifer vegetables[J].JournalofAdvancedResearch, 2010, 1:65-70.

[4]ZHANG Y S, CHO C G, GARY H P,etal. Spectroscopic quantitation of organic isothiocyanates by cyclocondensation with vicinal dithiols[J]．Anal.Biochem.， 1992, 205(1):100-107.

[5]GAO C, LIN J, ZHAO L,etal. Homocysteine S-methyl transferase regulates sulforaphane concentration inBrassicaoleraceavar.italica[J].IndianJournalofGeneticsandPlantBreeding, 2015, 75(3): 357-362.

[6]SONDERBY I E, GEU-FLORES F, HALKIER B A. Biosynthesis of glucosinolates-gene discovery and beyond[J].TrendsinPlantScience,2010, 15(5): 283-290.

[7]WANG H, WU J, SUN S,etal. Glucosinolate biosynthetic genes inBrassicarapa[J].Gene, 2011, 487(2): 135-142.

[8]ZANG Y X, KIM H U, KIM J A,etal. Genome-wide identification of glucosinolate synthesis genes inBrassicarapa[J].FEBSJournal, 2009, 276(13): 3 559-3 574.

[9]NAUR P, PETERSEN B L, MIKKELSEN M D,etal. CYP83A1 and CYP83B1, two nonredundant cytochrome P450 enzymes metabolizing oximes in the biosynthesis of glucosinolates inArabidopsis[J].PlantPhysiology, 2003, 133(1):63-72.

[10]HEMM M R, RUEGGER M O, CHAPPLE C. TheArabidopsisref2 mutant is defective in the gene encoding CYP83A1 and shows both phenylpropanoid and glucosinolate phenotypes[J].PlantCell, 2003, 15(1):179-194.

[11]BAK S, FEYEREISEN R. The involvement of two P450 enzymes, CYP83B1 and CYP83A1, in auxin homeostasis and glucosinolate biosynthesis[J].PlantPhysiology, 2001, 127(1): 108-118.

[12]张园园. 油菜和拟南芥中几个硫代葡萄糖苷合成及调控基因的功能分析[D]. 武汉: 华中农业大学, 2015.

[13]ZHU B, WANG Z, YANG J,etal. Isolation and expression of glucosinolate synthesis genes CYP83A1 and CYP83B1 in pak choi (BrassicarapaL. ssp.chinensisvar.communis(N. Tsen & SH Lee) Hanelt)[J].InternationalJournalofMolecularSciences, 2012, 13(5):5 832-5 843.

[14]曹阳理惠. 西兰花CYP83A1基因的克隆及功能验证[D]. 哈尔滨:东北农业大学, 2015.

[15]ZANG Y X, KIM J H, PARK Y D,etal. Metabolic engineering of aliphatic glucosinolates in Chinese cabbage plants expressingArabidopsisMAM1, CYP79F1, and CYP83A1[J].BMBReports, 2008, 41(6): 472-478.

[16]AUGUSTINE R, MAJEE M, PRADHAN A K,etal. Genomic origin, expression differentiation and regulation of multiple genes encoding CYP83A1, a key enzyme for core glucosinolate biosynthesis, from the allotetraploidBrassicajuncea[J].Planta, 2015, 241(3):651-665.

(编辑:宋亚珍)

Cloning and Expression Analysis of Sulforaphane Synthesis-related GeneBoCYP83A1 in Broccoli

GAO Canhong1, DONG Lili1，GUAN Xiaowan1, ZHAO Liangxia1, LIN Juncheng2,

XU Fule2, ZHANG Shuiming1*

(1 Anhui Agricultural University, Hefei 230036，China; 2 Fuzhou Chaoda Modern Agriculture Development Co. Ltd., Fuzhou 350003，China)

CYP83A1 is a key gene in sulforaphane biosynthesis and metabolism. The full length ofBoCYP83A1 was obtained from broccoli CDBY-10 by the methods of RACE and RT-PCR.BoCYP83A1 was 1 509 bp in length, encoded a deduced protein of 502 amino acids, and contained the conserved P450 domain. The expression level ofBoCYP83A1 in different cultivars, tissues, or seedlings treated with different hormones was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. Phylogenetic tree analysis showed that BoCYP83A1 had the closest relationship withBrassicaoleraceavar.oleraceaBoCYP83A1. Tissue-specific expression ofBoCYP83A1 in cultivars was different: expression difference in CDBY-10 was small. It showed stem>leaf>root in CDBY-12，while root > stem > leaf in CDBY-14. The treatments of MeJA and SA led to the changes ofBoCYP83A1 expression：after the MeJA treatment，the expression ofBoCYP83A1 was raised to 1.9 times of the control, and then decreased a little; After the SA treatment，the expression ofBoCYP83A1 reduced quickly，and upto 0.1 time of the control at 6 h, then restored gradually to the expression level of control. The results indicated that the expression characteristics ofBoCYP83A1 in broccoli cultivars were different, andBoCYP83A1 expression can be regulated by MeJA and SA. Cloning and characterization ofBoCYP83A1 gene provide the theoretical basis for breeding new broccoli cultivars with high sulforaphane content.

broccoli; sulforaphane;BoCYP83A1; MeJA; SA

1000-4025(2016)07-1302-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1302

2016-04-25;修改稿收到日期:2016-05-25

国家自然科学基金(30900971)；安徽农业大学稳定与引进人才科研资助项目(YJ 2013-13)

高灿红(1974-)，男，博士，主要从事蔬菜品质生物技术研究。E-mail:gaocanhong@163.com

张水明，博士，副教授，主要从事园艺植物种质资源与生物技术育种研究。E-mail:zhangshm893@sohu.com

Q785;Q786