张双翔，胡兴义，唐宇，冉隆仲，李涛，王慧

(1．贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550001;2．贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025;3．贵州省畜禽遗传资源管理站，贵州 贵阳 550001)

贵州省仔猪病毒性腹泻病原学调查

张双翔1，胡兴义2，唐宇3，冉隆仲1，李涛1，王慧1

(1．贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550001;2．贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025;3．贵州省畜禽遗传资源管理站，贵州 贵阳 550001)

为了解贵州省仔猪病毒性腹泻病原流行情况，对2013—2015年贵州省7个市(州)采集的35个规模养猪场316份仔猪腹泻粪便样品进行病原核酸检测。结果显示，各地均存在猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)感染，PEDV阳性率为62．43%，TGEV阳性率为7．91%，PoRV阳性率为11．76%。不同病原在不同地区呈显著流行趋势，且存在不同程度的混合感染，PEDV与PoRV混合感染率为18．04%，PEDV与TGEV混合感染率为5．06%，TGEV与PoRV混合感染率为3．80%，PEDV、TGEV与PoRV混合感染率为1．90%，近3年主要流行病原为PEDV。为临床防控仔猪病毒性腹泻发生提供了理论依据。

仔猪腹泻;猪流行性腹泻病毒;猪传染性胃肠炎病毒;猪轮状病毒;病原学调查

仔猪病毒性腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV)单独或混合感染引起所致［1］。各年龄阶段的猪群均易感染，其中对哺乳仔猪的危害最为严重，病死率最高［2］。这3种病毒引起的发病猪病理变化和临床症状极其相似，并常存在混合感染，给我国养猪业造成了巨大的经济损失［3］。

自2010年冬季以来，我国各省养殖场(户)的仔猪连续发生以腹泻为主要临床症状的疫病，大量研究报道表明多种病原与当前的疫情有关，并且药物治疗效果较差［4，5］。本研究对2013—2015年全省7个市(州)采集的35个规模养猪场316份仔猪腹泻粪便样品进行病原核酸检测，以了解仔猪病毒性腹泻病原地方流行情况，为防控腹泻疫病发生提供可靠依据。

1 材料和方法

1．1 腹泻病料于2013—2015年采自贵州省7个市(州)35个规模养猪场，临床表现腹泻症状仔猪1～10日龄粪便样品共计316份，置于－70℃保存备用。

1．2 主要试剂总RNA提取试剂盒、DNA Marker，购自天根生化科技(北京)有限公司;Prime ScriptR One Step RT－PCR kitVer．2，购自TaKaRa公司。

1．3 引物设计参照GenBank上登录的PEDV S基因(登录号:AF－353511)、TGEV S基因(登录号:FJ755618)、PoRV VP7基因序列(登录号:X04613)，按参考文献［4］设计3对引物(见表1)，由英维捷基(上海)生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

1．4 样品检测取一定量小肠内或刚排出的新鲜粪便加入pH 7．2的灭菌PBS，反复冻融2～3次，12 000 r/min 2 min，按照RNA提取试剂盒说明书进行，最后加入洗脱液25 μL，13 000 r/min 1 min，收集管中产物即为提取总RNA。建立20 μL反应体系，以设计引物进行RT－PCR扩增，反应件为:50℃30 min，95℃3 min，循环:94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，35个循环;72℃10 min。PCR产物经1．0%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2．1 阳性样本一步法RT－PCR扩增结果以PEDV、TGEV及PoRV阳性样品为模板，采用一步法RT－PCR方法分别进行扩增，结果见图1、图2、图3，PEDV、TGEV及PoRV 3种病毒阳性病料RTPCR扩增产物大小与预期大小一致，表明检测方法有效可行。

图1 PEDV

图2 TGEV

图3 PoRV

2．2 临床样品检测结果采用3对检测引物对316份病料样品进行RT－PCR检测，结果显示:PEDV阳性率为62．34%(197/316)，TGEV阳性率为7．91%(25/316)，PoRV阳性率为11．76%(37/316);PEDV发病率最高是黔南州，TGEV发病率最高是黔东南州，PoRV发病率最高是黔南州(见表2)。

表2 临床病料样品的RT－PCR检测结果

2．3 3种病毒混合感染调查结果对采集的316份发病仔猪腹泻粪便样本进行TGEV、PEDV和PoRV混合感染情况分析。结果显示，引起贵州省仔猪病毒性腹泻的病原除PEDV外，PEDV还与其他病毒混合感染，其中与PoRV混合感染率最高为18．04%，与TGEV混合感染率为5．06%，3种病原混合感染率为1．90%(见表3)。

表3 TGEV、PEDV和PoRV混合感染情况调查结果

2．4 不同时间PEDV、TGEV和PoRV病原核酸检测结果对采集的316份发病仔猪腹泻粪便样本进行PEDV、TGEV和PoRV病原检测。结果显示，近3年贵州省TGEV的阳性率依次为7．50%、6．72%、9．15%，呈上升趋势;PEDV的阳性率依次为90．00%、56．72%、59．86%，呈下降趋势;PoRV的阳性率依次为15．00%、9．70%、12．68%。通过比较得出近3年贵州省仔猪病毒性腹泻主要以PEDV为主(见表4)。

表4 不同时间TGEV、PEDV和PoRV病原核酸检测结果

3 讨论

3．1 仔猪腹泻的普遍存在是导致仔猪成活率不高的重要因素，对养猪业健康发展造成严重危害［6，7］。尤其自2011年冬季以来，仔猪病毒性腹泻在贵州省部分猪场暴发，损失严重。本研究对贵州省2013—2015年从贵阳、遵义、黔南等7个市(州)猪场采集腹泻仔猪新鲜粪便进行TGEV、PEDV和PoRV 3种病毒检测。结果显示，TGEV、PEDV和PoRV的阳性率分别为7．91%、62．43%、11．76%，PEDV与TGEV混合感染率为5．06%，PEDV与PoRV混合感染率为18．04%，TGEV与PoRV混合感染率为3．80%，TGEV、PEDV和PoRV 3种病毒混合感染率为1．80%。

3．2 刘云波等［8］2013年对全国13个省1 282份临床腹泻粪便进行检测，结果显示，TGEV、PEDV及PoRV的阳性感染率分别为2．65%、24．49%、3．20%;郭旋等［9］对2011—2012年广西自治区部分规模化养猪场的调查得出，TGEV、PEDV及PoRV的阳性感染率分别为0、37．50%、0．03%。这些研究与本研究均表明PEDV仍是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原。本研究显示较全国以及其他省的调查结果，PoRV的感染率出现了明显的上升趋势，这可能与本研究采样的猪场均未免疫三联弱毒疫苗有关。

3．3通过本调查表明，贵州省不同地区的腹泻猪场均有不同程度的PEDV感染，该病原的感染多在冬春季，不同地区和时间TGEV、PEDV和PRoV的感染率均有不同，表明寒冷是激发仔猪发生腹泻的重要因素之一。提示猪场管理人员在寒冷季节应加强仔猪饲养管理，提高舍内温度。

［1］田冲，欧阳金旭，等．仔猪病毒性腹泻的流行病学研究进展［J］．长江大学学报(自然科学版)，2013(5):57－60，63．

［2］Sun Rui－qin，Cai Ru－jian，Chen Ya－qiang，et al．Outbreak of porcine epidemic diarrhea in sucking piglets，China［J］．EmergInfect Dis，2012，18(1):161－163．

［3］Ben Salem A N，Chupin Sergei A，Bjadovskaya Olga P，et al．Multiplex nested RT－PCR for the detection of porcine enteric viruses［J］．J Virol Methods，2010，165(2):283－293．

［4］Pan Yong－fei，Tian Xiao－yan，Liu Wei，et al．Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China［J］．Virol J，2012，12(9):195．

［5］陈蕾，朱玲，李松，等．猪流行性腹泻病毒VP1基因的克隆及生物信息学分析［J］．中国兽医科学，2012，34(12):1254－1258．

［6］韩淑芳．仔猪病毒性腹泻研究进展［J］．北京农业，2014(36):163．

［7］李松华．仔猪病毒性腹泻的特点和防控措施［J］．湖北畜牧兽医，2012(2):21－23．

［8］刘云波，赵洪翠，王志成，等．猪病毒性腹泻分子流行病学调查［J］．中国畜牧兽医，2013，40(2):204－207．

［9］郭旋，陈静，刘欢，等．广西仔猪腹泻病毒病原流行病学调查［J］．南方农业学报，2013，44(1):155－160．

The Etiological Investigation on Viral Diarrhea of Piglets in Guizhou Province

Zhang Shuangxiang1，Hu Xingyi2，Tang Yu3，Ran Longzhong1，Li Tao1，Wang Hui1
(1．Animal Disease Prevention and Control Center in Guizhou Province，Guiyang Guizhou 550001，China;2．College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang Guizhou 550025，China;3．Guizhou Province Station for Livestock Genetic Resources Management，Guiyang Guizhou 550001，China)

We wished to understand the epidemic situation of piglet viral diarrhea in Guizhou province，in 35 large－scale pig farms in 7 cities(state)collected to detect pathogenic nucleic acid on 316 fecal samples of piglets during the year of 2013 to the year of 2015 in Guizhou province．The investigation results display that porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)，transmissible gastroenteritis virus(TGEV)and porcine rotavirus(PoRV)infection in different regions，the positive rate of PEDV is on 62．43%，TGEV on 7．91%and PoRV on 11．76%．Different pathogens showed significant trends in different regions，and there are different levels of mixed infection，the mixed infection rate PEDV with PoRV is on 18．04%，PEDV with TGEV on 5．06%，TGEV with PoRV is on 3．80%，PEDV，TGEV with PoRV is on 1．90%，In the past 3 years，the main epidemic pathogen was PEDV．The investigation that provides a theoretical basis for the prevention and control of viral diarrhea in piglets．

Piglet Diarrhea;Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV);Transmissible Gastroenteritis Virus(TGEV);Porcine Rotavirus(PoRV);Etiological Investigation

S858．28

A

1007－1474(2016)06－0008－03

2016－09－19

贵州省科学技术厅农业攻关项目(黔科合NY［2015］3009－1号);“贵州省动物疫病防控与兽医公共卫生保障科技创新人才团队”(黔科合人才团队［2015］401号6)

张双翔(1987—)，男，兽医师，硕士，从事动物疫病综合防控工作。