邓粤敏，徐韫健

(1.广州医科大学附属肿瘤医院检验科，广州 510095；2.广州医科大学附属第一医院检验科，广州 510120)



PIK3CA基因突变状态在乳腺癌不同临床病理特征中的研究

邓粤敏1，徐韫健2△

(1.广州医科大学附属肿瘤医院检验科，广州 510095；2.广州医科大学附属第一医院检验科，广州 510120)

目的检测乳腺癌组织磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α(PIK3CA)基因突变状态，并分析突变与临床病理特征的关系。方法选取176例原发性乳腺癌患者石蜡组织标本，提取组织DNA，对外显子9及20 进行探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应(ARMS-PCR)扩增，检测PIK3CA基因的突变状态，另取20 例乳腺腺病组织标本作为阴性对照。结果176 例乳腺癌组织中发现突变45例，突变率25.6%，其中以20号外显子H1047R突变率为主，突变率26.7%(12/45)；PIK3CA 基因突变在ER阳性和阴性、PR阳性和阴性患者中差异有统计学意义(P<0.05)，但在HER2阳性和阴性患者中差异无统计学意义(P>0.05)；PIK3CA基因突变与乳腺癌患者肿瘤大小、年龄、淋巴结状态之间无明显相关性，但与组织学分级有相关性。结论PIK3CA基因突变与乳腺癌激素受体表达和肿瘤进展相关，PIK3CA 基因突变检测对指导临床制订个体化治疗有重要意义。

乳腺癌；PIK3CA 基因；突变

乳腺癌是严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤，其发病率逐年上升，并趋于年轻化，目前已成为女性发病第一的恶性肿瘤，约占女性恶性肿瘤的16%[1]。乳腺癌肿瘤组织的雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和表皮生长因子受体-2(HER2)的表达对乳腺癌预后的判断及治疗方案的选择具有重要的指导意义。乳腺癌发生和发展的分子机制主要为癌基因激活和抑癌基因失活导致细胞异常增殖。磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α(PIK3CA)基因突变通过PIK3/AKT信号通路与乳腺癌的发生相关[2]。本研究通过对乳腺癌组织中的PIK3CA基因外显子9和20两个突变区检测，探讨 PIK3CA基因突变和乳腺癌分子病理及临床特征的联系，为本地区乳腺癌患者的个体化诊疗提供新思路，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选择2014～2015年广州医科大学附属肿瘤医院和广州医科大学附属第一医院收集的原发性乳腺癌组织176例。患者入选标准：(1) 所有病例均经病理科确诊均为乳腺癌并用免疫组织化学方法分型；(2)确保所获得的标本能满足检测需要；(3)取材均符合伦理要求。年龄36～65 岁，平均(50.2±9.80)岁。另收集乳腺腺病20例标本作对照。

1.2主要试剂和仪器人类PIK3CA基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)和石蜡包埋组织DNA提取试剂盒均购自厦门艾德生物医药科技有限公司；微量紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific公司；CFX96荧光定量PCR仪购自美国BIO-RAD公司。

1.3方法

1.3.1组织学评价常规对乳腺癌术后病理组织进行免疫组织化学检测，测定ER、PR和HER2水平。ER及PR阳性定义：≥1%肿瘤细胞核内表达激素受体标记阳性。HER2呈(+++)时为阳性：>10%的肿瘤细胞呈现强而完整的细胞膜染色；(-)/(+)判为阴性；(++)表示>10%的肿瘤细胞呈现不完整和(或)弱至中等程度的细胞膜染色，应该用免疫组织化学做进一步检测或选取不同的组织块重新检测[3]。ER、PR和HER2均表达缺失的乳腺癌为三阴性乳腺癌。

1.3.2组织学分级从以下3个方面进行评估：(1)腺管形成，有多数明显腺管为1分，有中度分化腺管为2分，细胞呈实性片块或条索状生长为3分。(2)细胞核大小、形状及染色质不规则，细胞核大小、形状及染色质一致为1分，细胞核中度不规则为2分，细胞核明显多形性为3分。(3)染色质增多及核分裂象(×400)，1/10HPF为1分，2～3/10HPF为2分，>3/10HPF为3分。各标准的3项指标所确定的分数相加，3～5分为Ⅰ级(分化好)，6～7分为Ⅱ级(中等分化)，8～9分为Ⅲ级(分化差)。

1.3.3石蜡切片样品病理评估抽取用于检测的连续切取石蜡切片一张，HE染色。低倍镜下评估全片肿瘤组织的分布情况，如存在明显的无肿瘤区域，蜡笔划出，在所有待检测石蜡切片上剔除该部分。高倍镜下选择切片上、下、左、右、中5个视野，每个视野连续计数细胞30个，合并5个视野的计数结果，计算平均肿瘤细胞含量作为送检样品的肿瘤细胞含量。

1.3.4DNA提取及ARMS-PCR反应采用手工-柱提取法，严格按照艾德石蜡包埋组织DNA提取试剂盒的说明进行操作。组织DNA调整浓度到3.0 ng/μL加样，严格按照艾德人类PIK3CA基因突变检测试剂盒的说明进行。PCR反应参数如下：95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃20 s，15个循环；93 ℃25 s，60 ℃35 s，72 ℃ 20 s，31个循环。在第三阶段60 ℃收集信号。

1.4统计学处理采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析。分析PIK3CA基因突变的状态与乳腺癌分子亚型、临床病理特征关系用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1PIK3CA基因突变检测结果176例乳腺癌组织中，PIK3CA基因突变 45例，突变率 25.6%，其中E542K突变10例(22.2%)，E545D突 变5例(11.1%)，E545K突变9例(20.0%),H1047R突变12例(26.7%)，H1047L突变3例(6.7%)。E542K、E545K、E545D均位于外显子9，编码螺旋区；H1047R、H1047L 位于外显子20，编码激酶区。在对照组20例良性病中均没发现PIK3CA基因突变。

2.2PIK3CA基因突变在乳腺癌不同肿瘤特征中的分布PIK3CA基因突变在乳腺癌分子亚型中：ER阳性型37例(30.6%)，PR阳性型35例(31.0%)，HER2 过表达型8例(27.6%)，三阴性乳腺癌3例(8.6%)。PIK3CA 基因突变在ER阳性和阴性、PR阳性和阴性患者中差异有统计学意义(P<0.05)，但在HER2阳性和阴性患者中差异无统计学意义(P>0.05)；三阴组的PIK3CA基因突变率均低于各阳性组。见表1。

表1　PIK3CA基因在乳腺癌不同肿瘤特征中的突变状态

注：-表示无数据。

表2　PIK3CA基因在不同临床病理特征中的突变

2.3PIK3CA基因突变与患者临床病理特征的关系PIK3CA基因突变与患者的年龄、淋巴结转移和肿瘤大小均无相关性，但与组织学分级有相关性，Ⅱ和Ⅲ级的PIK3CA基因突变率远远高于Ⅰ级(P<0.05)。见表2。

3　讨　论

PIK3CA基因编码Ⅰ类磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的p110催化亚单位，PI3K是一种脂质激酶，是由调节亚基p85和催化亚基p110组成的异源二聚体。PIK3CA是目前PI3K家族成员中发现的唯一一个可以发生体细胞突变而致癌的基因。PIK3CA基因突变通过PI3K/AKT的途径引发 AKT持续活化，导致成纤维细胞和乳腺上皮细胞的生长和转化，抑制细胞凋亡，与乳腺癌发生和发展相关密切。研究表明，在乳腺癌中发现PIK3CA 基因突变发生率为8%～40%，约4/5发生在螺旋区(exon9)和激酶区(exon20)这两个热点区域[4]。本研究PIK3CA基因突变率为25.6%，以20号外显子H1047R突变为主，在20例良性对照组中均没发现PIK3CA基因突变，基本与国内外报道[5-6]相符。

本研究中PIK3CA基因突变在乳腺癌不同分子亚型中突变发生率不同，在ER阳性和阴性、PR阳性和阴性患者中差异有统计学意义(P<0.05)，但在HER2阳性和阴性患者中差异无统计学意义(P>0.05)；三阴组的PIK3CA基因突变率均低于受体阳性组。PIK3CA基因突变存在于所有类型的乳腺癌中，更常见于PR阳性及ER阳性的乳腺癌。这与文献[7]报道PIK3CA基因突变在激素受体(HR)阳性组(21.5%)比HR阴性组(15.4%)更加频繁相符，其中HR阳性组包含了PR阳性及ER阳性。目前有关PIK3CA基因突变和HER2表达关联的报道研究结果不完全一致。有报道认为PIK3CA基因突变与HER2阴性表达相关，HER2基因扩增的乳腺癌PIK3CA基因突变率较无HER2基因扩增的乳腺癌低[8]；而另一些报道则认为PIK3CA基因突变和HER2过表达相关，HER2基因扩增的乳腺癌PIK3CA基因突变率远高于无HER2基因扩增的乳腺癌[9]，而本研究与此报道相符。与患者临床病理特征的关系上，PIK3CA基因突变与患者的年龄、淋巴结转移和肿瘤大小均无相关性，但与组织学分级有相关性，Ⅱ～Ⅲ级的PIK3CA基因突变率远远高于Ⅰ级(P<0.05)，提示PIK3CA 基因突变可能在乳腺癌的发生、发展中起作用。Bozhanov等[10]报道 PIK3CA 基因突变与淋巴结转移和肿瘤分级相关,本研究与此报道部分不符合，可能与研究病例和地域不同有关。

PIK3CA基因状态还决定靶向药物赫赛汀、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)、抗EGFR单抗和PI3K抑制剂的疗效，HER2阳性乳腺癌患者的靶向药物主要为赫赛汀和拉帕替尼。据Majewski等[11]研究在HER2阳性乳腺癌中，PIK3CA野生型患者的病理完全缓解率为53.1%，而PIK3CA基因突变患者的病理完全缓解率为28.6%。Henry 等[12]的研究也发现PIK3CA基因突变的乳腺癌患者的病理完全缓解可能性较低，无进展生存期较短。由于PIK3CA基因突变的HER2阳性乳腺癌患者接受赫赛汀治疗的疗效显著降低，总生存期显著缩短。因此，PIK3CA基因突变的HER2阳性乳腺癌患者将对化疗和抗HER2治疗产生耐药，需要对此类人群确定其他的治疗方案。

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Study of PIK3CA gene mutation status in different clinicopathological characteristics of breast cancer

DENG Yuemin1,XU Yunjian2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedTumorHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510095,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510120,China)

ObjectiveTo detect the mutation status of PIK3CA genes in breast cancer and to analyze its relation with clinicopathological characteristics.MethodsThe paraffin tissue samples in 176 cases of breast cancer were selected and the tissue DNA was extracted,exon9 and exon20 were amplified by ARMS-PCR.The mutation status of PIK3CA genes were detected,other tissue samples in 20 cases of mammary gland disease were taken as the negative control.ResultsAmong 176 samples of breast cancer tissues,45 cases of mutation were found with the mutation rate of 25.6%,which was dominated by H1047R mutation rate of exon20 with the mutation rate of 26.7%(12/45)；There were statistical difference between ER(+) and ER(-) and between PR(+) and PR(-),but no statistical difference was found between HER(+) and HER(-);PIK3CA gene mutation had correlation with cancer histological grade,but no obvious correlation with tumor size,age and lymph node status.ConclusionPIK3CA gene mutation is correlated with breast cancer hormone receptor(HR) expression and tumor progression;the PIK3CA gene mutation detection has an important significance for guiding the formulation of clinical indiidualized treatment.

breast cancer;PIK3CA;mutation

2016-01-24修回日期：2016-05-06)

邓粤敏，女，主管检验技师，主要从事临床检验技术研究。△

，E-mail：vinkent@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.022

A

1673-4130(2016)15-2110-02

·论著·