曾　吉，金　策，黄舟莹，李　辰，王瑞琦

(1.湖北省武汉市普爱医院检验科　430033；2.华中科技大学同济医学院医学检验系，武汉430031)



棘白菌素对念珠菌体外药敏试验产生“矛盾现象”的分析

曾吉1，金策1，黄舟莹2，李辰2，王瑞琦2

(1.湖北省武汉市普爱医院检验科430033；2.华中科技大学同济医学院医学检验系，武汉430031)

摘要:目的观察棘白菌素对念珠菌的“矛盾现象”。方法体外药敏试验中，采用微量稀释法分别观察卡泊芬净和米卡芬净对180株念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)和“矛盾现象”。结果卡泊芬净对白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌均产生“矛盾现象”，发生率分别为66.0%、77.5%、55.0%和35.0%，各菌矛盾现象的起点/终点中位数浓度分别为8/32、16/32、8/32、4/16 μg/mL；米卡芬净只对白色念珠菌和热带念珠菌产生“矛盾现象”，发生率分别为45%和67.5%，各菌矛盾现象的起点/终点中位数浓度分别为4/16、8/32 μg/mL。结论“矛盾现象”的产生存在念珠菌种间差异性和棘白菌素类药物特异性。卡泊芬净出现“矛盾现象”的发生率高于米卡芬净。各菌株对卡泊芬净、米卡芬净产生“矛盾现象”的发生率与MIC的高低无明显相关性。

关键词:念珠菌；卡泊芬净；米卡芬净；矛盾现象

棘白菌素是一类新型的抗真菌药物,能非竞争性抑制真菌细胞壁β-1,3-D-葡聚糖合成酶,造成真菌细胞壁中β-葡聚糖减少，引起细胞结构破坏，有较高的特异性,能迅速杀灭真菌[1]。因为哺乳类动物的细胞中不存在β-1,3-D-葡聚糖合成酶,故该类化合物对人体正常细胞影响不大。作为一种新型抗真菌药物,棘白菌素类抗真菌药已在临床逐步推广应用[2]。目前国内外均有试验发现进行体外药敏试验棘白菌素作用于念珠菌属会出现低浓度时抑制、高浓度时出现菌落生长的“矛盾现象”[3]。目前此现象和临床关系尚未明确。已有研究通过对不同念珠菌种对卡泊芬净、米卡芬净体外药敏试验出现“矛盾现象”的动态观察，念珠菌属对卡泊芬净、米卡芬净的体外药敏试验有可能出现“矛盾现象”，并具有一定的对应关系[4]。本研究通过微量稀释法验证了“矛盾现象”的存在，并初步探讨了“矛盾效应”的发生率。

1材料与方法

1.1材料菌株：收集武汉地区从临床患者分离的念珠菌共180株，包括白色念珠菌100株、热带念珠菌40株、近平滑念珠菌20株、光滑念珠菌20株。使用近平滑念珠菌ATCC22019作为质控菌株。

1.2仪器与试剂卡泊芬净(美国Merck公司)，米卡芬净(日本Fujisawa公司)。RPMI1640(干粉装，Sigma)，MOPS缓冲液(干粉装，Sangon)。

1.3方法

1.3.1真菌接种液制备各受试念珠菌株先在沙氏培养基上转种2 次，再经24 h培养后，选择直径大于1 mm的菌落5个，将其用0.85%的无菌盐水制成悬液。用牛鲍计数板计数孢子，调整含菌量，使集落形成单位(CFU)为(1～5)×106/mL，待用。

1.3.2最低抑菌浓度(MIC)和“矛盾效应”的测量参考CLSI M27-A3文件推荐的微量液基稀释法的规范[5]，本研究依据实际情况作出修改，药物浓度梯度设计为0.03～64.00 μg/mL,共12组浓度梯度。往已稀释好的含有不同药液的微孔中加入待测菌液，使真菌接种液最终CFU调至(0.5～2.5)×103/mL。最终96孔板每孔体积为200 μL，35 ℃培养48 h。

1.3.3结果判定48 h后肉眼观察结果，肉眼判读MIC和“矛盾效应”的起始浓度和终止浓度。在高于MIC 2倍稀释浓度以上出现菌落生长的情况判定为“矛盾现象”。

2结果

卡泊芬净和米卡芬净白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌的MIC90都比较低，没有发现耐药株，对近平滑念珠菌的MIC较高，MIC50、MIC90分别为1.00、2.00 μg/mL。卡泊芬净对这4种念珠菌均有“矛盾现象”出现，米卡芬净只对白色念珠菌和热带念珠菌有“矛盾现象”出现。卡泊芬净对念珠菌“矛盾现象”起点浓度中位数较米卡芬净高，见表1。

表1　　念珠菌对卡泊芬净、米卡芬净出现 “矛盾现象”

注：-表示未检测。

3讨论

本研究测定了卡泊芬净和米卡芬净对念珠菌的MIC，结果显示卡泊芬净和米卡芬净对白色念珠菌和热带念珠菌的MIC90/MIC50均分别为0.13/0.25 μg/mL和0.03/0.03 μg/mL，对光滑念珠菌分别为0.03/0.03 μg/mL和0.03/0.25 μg/mL，与Macro等[6]、Pfaller等[7]、曾荣等[8]报道相似。卡泊芬净和米卡芬净对近平滑念珠菌的 MIC90/MIC50为1.00/0.50 μg/mL和2.00/1.00 μg/mL。本研究结果表明，棘白菌素类药物卡泊芬净、米卡芬净对念珠菌总体有较好的抗菌作用，其中对白念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌的MIC值较低，对近平滑念珠菌的MIC值相对其他3种念珠菌高。

本研究证实了棘白菌素对念珠菌“矛盾现象”的存在，卡泊芬净较米卡芬净更易出现“矛盾现象”。本研究中，所有念珠菌在卡泊芬净作用下均出现该现象，且发生率远高于米卡芬净。对比MIC浓度和“矛盾现象”起点/终点浓度发现两者无明显相关性。本研究中，“矛盾现象”的发生率与曾荣等[8]研究结果相似，但显著高于Fleischhacker等[9]报道的结果，出现差异可能与实验的样本量较小、菌种来源不同等多种因素有关。

本研究发现，“矛盾现象”发生率的变化存在念珠菌种属差异性和棘白菌素类药物特异性，而且与药物作用时间有一定的关系。卡泊芬净“矛盾现象”发生率的变化情况较米卡芬净更加明显，且发生率更高。一定时间内“矛盾现象”的发生率会随药物作用时间增加而有所增加。目前，“矛盾现象”的原因尚无定论。有观点认为“矛盾现象”是念珠菌在高浓度棘白菌素类药物作用时产生的一种自身保护性代偿机制，其通过改变细胞壁组分而免受药物杀伤。其产生机制目前还未完全阐明，可能的机制有念珠菌细胞壁几丁质含量升高、细胞壁蛋白激酶C(PKC)途径等[10-12]。

本研究结果表明，念珠菌属对卡泊芬净、米卡芬净的体外药敏试验有可能出现“矛盾现象”，其与药物特异性有关，并和药物作用时间有一定的对应关系，但其发生率无确定参考范围。不同念珠菌种的“矛盾现象”出现的时间、起点/终点不一，同一菌种不同菌株之间也存在差异。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.046

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)14-2008-02

(收稿日期：2016-01-17修回日期：2016-03-19)