袁文声，易　峰

(广东省中山市中心血站　528400)



IgA缺乏症献血者酶联免疫试验筛查方法的建立*

袁文声，易峰

(广东省中山市中心血站528400)

摘要:目的建立适合用于大规模IgA缺乏症献血者筛选的ELISA检测方法。方法采用间接酶联免疫法，在微孔板中包被羊抗人IgA、用辣根过氧化物酶标记羊抗人IgA抗体作为酶标二抗。结果建立的ELISA测定法灵敏度为0.1 μg/mL，IgA浓度为0.1、100 μg/mL的批间变异系数(CV)是1.74%、3.49%，批间CV中位数为3.48%(范围：1.83%～6.96%)。检测过程约80 min。结论成功建立了IgA缺乏症筛查的ELISA测定法，其灵敏度高、特异度强、省时、操作简易，可用于大规模筛选IgA缺乏症献血者及建立IgA缺乏献血者库。

关键词:IgA；酶联免疫试验；IgA缺乏；献血者

选择性IgA缺乏症是指血清IgA低于0.05 g/L或缺失，而IgG和IgM血清浓度正常，是免疫缺陷中最常见的类型[1]。IgA缺乏症患者接触外来抗原免疫刺激后，体内会产生抗IgA抗体，当输注含IgA的血液或血制品时可引起严重过敏性休克反应，因此可选择性输注IgA缺乏献血者的血液制品。迄今为止中国人群健康献血者中IgA缺乏症患者的大规模筛查鲜有报道，在血站日常的献血样本筛选中，并无IgA缺乏症的专项检测，所以中国人群IgA缺乏症患者的输血存在潜在隐患。本研究拟建立灵敏度高、特异度强，尤其是高通量的ELISA法，用于大规模的献血者筛查，建立IgA缺乏症献血者库。

1材料与方法

1.1仪器与试剂96孔平底微板(Grerner，德国)，水浴箱(德国JULABO,SW22)，酶标仪(安图Phomo)，微量加样器(安图Lisa)，鼠抗人IgA单克隆抗体(SBA，美国)，人标准血清(Athens Research & Technology，美国)，辣根过氧化酶羊抗人IgA抗体(SBA，美国)，浓缩包被缓冲液(Thermo Scientific，美国)，封闭液(Thermo Scientific，美国)，底物显色液TMB(Thermo Scientific，美国)，终止液(上海迪申生物)，20×PBS缓冲液(上海迪申生物)，吐温Tween-20(上海思吉)。

1.2方法

1.2.1包被微板用包被缓冲液(pH9.6，0.05 mmol/L碳酸盐缓冲液)将鼠抗人IgA抗体以1∶1 000稀释，每孔加入100 μL，用封口膜封板，轻轻震荡混匀，置于4 ℃冰箱孵育过夜；次日每孔加入0.05%T-PBS(由20×PBS和吐温Tween-20配制而成，吐温质量分数为0.05%)300 μL/孔，洗涤3次，扣干后加入200 μL/孔封闭液；将微孔板置于37 ℃水浴箱孵育，30 min后取出，重复洗板3次。待板扣干后密封存于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2加标准品和样品血清先将人标准血清稀释成1、10、102、103、104共4个浓度梯度，最终浓度从高至低分别为100、10、1、0.1、0.01 μg/mL。加入到96孔板中纵向相应位置,每孔100 μL； 将血清样本作1∶100稀释后加100 μL到96孔板中纵向相应位置，(37±1)℃培养30 min。6次洗板后，向每个微孔中添加在1/4 000洗涤液稀释的100 μL辣根过氧化酶偶联二抗，并在37 ℃下培养30 min。洗板6次后，加100 μL/孔底物显色液TMB，并在22 ℃下的黑暗中孵育20 min。加入50 μL的4N硫酸终止反应，测定每孔在492 nm下的吸光度(OD)，设定参考波长为620 nm。吸光度值均按照样品空白校正，其中包括人类IgA缺乏血浆。为了实现检测的标准化，通过稀释IgA缺乏人类血浆制备的参考IgA获得已知浓度的IgA。每个IgA稀释液都按照上述描述经过了6次处理，并且计算了平均，标准偏差(s)，关于平均值的99%可信区间(CI)，OD的变异系数(CV)。

2结果

2.1ELISA标准曲线及评测评估使用对照IgA制备物的稀释液，制作了与OD到IgA浓度有关的标准化和检测灵敏度A标准曲线。IgA浓度的OD为0.01 μg/mL，与IgA缺乏血浆的OD重叠。相比之下，IgA浓度为0.1 μg/mL的平均OD周围的99%CI的下限，是IgA缺乏血浆平均值99%CI上限的3.1倍。因此，检测灵敏度为0.1 μg/mL，因为这是能与空白明显区分的最低IgA浓度。

2.2ELISA精确性、灵敏度和重复性IgA浓度在0.1 μg/mL和100 μg/mL范围内的批内检测CV从1.74%到3.49%变化，见表1。通过分析6次检测中正常献血者的20个样品，评估了批间检测CV。OD的批间检测CV中位数为3.48%(范围：1.83%～6.96%)，见表2。

表1　　不同浓度的IgA标准人血清在波长450 nm处对应的OD和CV值

注：OD为450 nm波长处重复3孔的平均值。

表2　　20例正常献血者IgA检测的OD和CV值

注：OD为450 nm波长处重复3孔的平均值。

2.3ELISA高剂量钩状效应为了测试因献血者血浆的高IgA水平导致假阴性结果的可能性(高剂量钩状效应)，本研究对人体单克隆IgA倍比稀释，最终IgA浓度范围是6.8～96.7 μg/mL。在所有情况下，OD值仍很高，证明该检测不具有高剂量钩状效应倾向。

3讨论

研究发现，多数IgA缺乏的患者血浆中含有IgA抗体，这类个体在接受含有IgA血液成分时，可能会发生严重的过敏性反应，虽然该过敏性反应的频率仅为1∶20 000～1∶47 000名受血者之间，但也成了最常见的非溶血性输血相关病死率原因之一[2-4]。故此血浆中含抗IgA的患者应接受低IgA的血液成分，最理想的是含有IgA<0.5 μg/mL的血液成分。

对于这类含IgA抗体的IgA缺乏患者输血治疗一般有3种方法[5]：自体血液输注；采用经多次洗涤后的红细胞或血小板；输注IgA缺乏献血者的血液成分。自体血液输注对于失血过多的患者不可行，而通过反复洗涤细胞可以获得低IgA红细胞和血小板，然而操作繁琐、耗时费力，且对于高度致敏受血者是不够的，同时不适合那些需要输注血浆或冷沉淀的患者，故此输注IgA缺乏献血者的血液成分似乎是更好的选择。

已报道的对IgA缺乏的检测方法有放射免疫扩散法、免疫比浊法、放射免疫、被动凝集抑制试验等[6-8]。放射免疫扩散、免疫比浊法和放射免疫的灵敏度很低，检测时间长，无法轻易实现自动化，或者需要昂贵的仪器。被动凝集抑制试验用于某些血站筛选IgA缺乏的献血者。这个试验的一个优势，是可以适应自动化设备，灵敏度在0.5 μg/mL左右，并且检测时间较短，然而该试验需要繁复的红细胞包覆步骤，以及相对专业的技能，才能得到满意的效果。此外，若献血者血清中存在抗红细胞抗体，容易发生假阳性反应[9]。因此，上述方法应用于大规模人群筛查IgA缺乏症时有局限性，而ELISA法由于其灵敏度高、特异度强尤其是高通量的优点适用于大规模的人群筛选，但是相关报道中仍存在需要改进的地方。本研究拟建立灵敏度高、特异性强尤其是高通量的ELISA检测法，用于大规模的献血者筛选，建立IgA缺乏症献血者库。

本研究建立的ELISA灵敏度水平，与那些报道的类似测定法相比，也毫不逊色，其范围为0.5～5 μg/mL，低于IgA缺乏血液成分提出的0.5 μg/mL阈值的5倍[7-8,10]，精度也令人满意，因为在测定法灵敏度极限中IgA浓度CV仅为3.49%，而对于批间重复性评估，CV都低于6.96%。对IgA缺乏献血者进行了明确区分，因为正常和IgA缺乏样品之间OD的差异约为105倍。理论上，因为邻孔污染，可能导致一些IgA缺乏症献血者未被发现。然而，不同微孔板中反复测定IgA缺乏症患者血清标本，没有发现污染；另外，因“高剂量钩状效应(抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象)”造成的检测错误也是不可忽视的，即把IgA血清水平异常高当成IgA缺乏，这一作用在一步夹心法中发生，原因为过量的被测物与固相蛋白及标记蛋白争相结合，难以或不能有效地形成夹心结合物，使强阳性标本误测为弱阳性甚至假阴性结果[11]。高剂量钩状效应在两步法检测中是非常罕见的，本研究测试了IgA浓度非常高的样品后，发现OD值仍很高，证明该检测不具有高剂量钩状效应倾向。

本研究中的96孔测试板可以通过使用自动样品处理仪来制备，用于分配包被抗体，洗涤和封闭试剂。此外，微孔板可以冷冻存储，性能上没有任何损失，至少可存贮存3个月。因此，在处理便利性，稳定性和重现性方面，它可以与一个商用的试剂盒媲美。本研究建立的ELISA法在试剂成分、实验条件、实验时间、灵敏度上都作了优化和改进，并做了质控阴性对照和空白对照使实验更符合标准操作规范，与文献报道采用的其他方法相比，解决了检测时间长、对实验人员有危害等不足之处。

综上所述，本研究建立的方法与已有技术相对照,其效果是积极和明显的。由于快速、经济、简便、检测数量大，本方法可以应用于临床医疗单位及血站的常规血液检测，为IgA缺乏症患者减少输血风险，提高了输血的安全性，接下来利用已建立的这种可靠的方法进行中国汉族健康献血者的缺乏筛查。

参考文献

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* 基金项目：广东省中山市科技计划项目(2015B1251)。

作者简介：袁文声，女，副主任医师，主要从事临床输血与检验研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.020

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)14-1951-03

(收稿日期：2016-01-11修回日期：2016-03-22)

Establishment of ELISA screening method in blood donors with IgA deficiency*

YUANWensheng,YIFeng

(ZhongshanMunicipalBloodCenter，Zhongshan,Guangdong528400,China)

Abstract:ObjectiveTo establish the enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA) method for a large-scale screening of IgA deficiency in blood donors.MethodsThe indirect ELISA was adopted.The goat anti-human IgA antibody was coated in microwell plates and labeled by horse radish peroxidase (HRP) as enzyme-labelled secondary antibody.ResultsThe sensitivity of established ELISA detection method was 0.1 μg/mL.The intraassay coefficients of variation (CV) for IgA concentrations of 0.1,100 μg/mL were 1.74% to 3.49%.The median interassay CV was 3.48%(range:1.83%-6.96%).The assay process was 80 min.ConclusionThe ELISA detection method is successfully established with high sensitivity,strong specificity,timesaving and easy operating and can be used for a large scale screening of Ig A deficiency and establishment of blood donors bank of Ig A deficiency.

Key words:IgA；enzyme immunoassay；IgA deficiency；blood donor