李宗杰，宫璀璀△，金星星,代　稳

(1.郑州大学第三附属医院科研中心　450000；2.中国人民解放军第153中心医院检验科，郑州 450042；3.武警河南总队医院检验科，郑州 450000)



BestSeqTM技术在进行性肌营养不良症基因突变检测中的应用

李宗杰1,2，宫璀璀1,2△，金星星3,代稳2

(1.郑州大学第三附属医院科研中心450000；2.中国人民解放军第153中心医院检验科，郑州 450042；3.武警河南总队医院检验科，郑州 450000)

摘要:目的应用BestSeqTM新一代致病基因检测技术对进行性肌营养不良患者进行基因检测，验证该方法的敏感度和特异性。方法应用BestSeqTM新一代致病基因检测技术，对2例肢带型肌营养不良患者、6例杜氏肌营养不良患者进行基因测序，对发现的点突变应用Sanger测序进行验证。结果研究完成了上述8例患者的基因检测，共检测出大片段缺失变异2个，微小突变10个，其中8个微小突变为首次发现的新突变，经Sanger测序验证。结论BestSeqTM新一代致病基因检测利用高密度叠瓦式探针及多重标签技术大大提高了检测效率，具有很好的临床应用前景。

关键词:进行性肌营养不良；基因检测；微小突变

进行性肌营养不良(PMD)是一组异质性肌肉退化的遗传性疾病，最常见的肌营养不良是Duchenne型肌营养不良(DMD)，其他肌营养不良包括肢带型肌营养不良(LGMD)、Emery-Dreifuss肌营养不良(EDMD)等，目前尚无有效的根治方法，对个人、家庭和社会造成沉重的心理和经济压力[1-2]。近年来，随着对遗传性肌营养不良症分子遗传学研究的不断深入，大大提高了疾病诊断的准确性。但由于遗传性肌营养不良症的基因庞大而复杂，存在着多种可变的剪接方式，自发突变率高。因此对于探索简便、准确、快速、经济的基因突变检测技术就显得尤为重要。本文应用BestSeqTM新一代致病基因检测技术对遗传性肌营养不良患者进行基因检测，探索了BestSeqTM新一代致病基因检测技术对遗传性肌营养不良症的诊断价值，为遗传性肌营养不良症的基因诊断和治疗提供了实验手段。

1资料与方法

1.1一般资料选取2014年5月至2015年9月在郑州大学第三附属医院小儿科及神经内科门诊就诊，临床拟诊断为进行性肌营养不良的8例患儿，家族史均阴性，其中6例拟诊断为杜氏肌营养不良患儿均有运动发育障碍，主要表现为摇曳步态，Gower′s征阳性，下肢病变早于上肢呈对称性发展，下肢近心端肌肉萎缩明显，肌肉活检示不透明肌纤维交错现象，细胞质内囊泡非边缘分部，血清肌酸激酶(CK)水平明显升高，提示肌营养不良性肌病。2例拟诊断肢带型肌营养不良患者，表现为近端肌无力，肌腱反射减弱，累及骨盆及肩带肌，CK水平明显升高，病理检查显示营养不良性肌病。

1.2方法

1.2.1基因芯片捕获和第二代基因测序提取患者gDNA，按试剂盒(QIAamp DNA blood Midi Kit Qiangen,Hilden,Germany)说明操作。二代测序gDNA建库，取gDNA 1 μg经自适应高聚焦超声(Covaris S2,Covaris公司)随机打断成200～300 bp的片段，用试剂盒(AMPure Kit，Agencourt公司)对片段样本进行纯化，应用T4聚合酶、T4PNK和大肠杆菌聚合酶Klenow片段进行DNA片段的末端修补及在3′端加A尾，通过Paird-end链接接头反应建立文库，以Illumina公司提供的与接头相配套的引物进行扩增，并插入Index序列，利用Agilent(美国Agilent公司)SureDesign在线设计工具，设计针对目标基因外显子及侧翼序列(±10 bp)的靶向捕获探针，定制专门的目标基因捕获试剂盒，经杂交捕获后，对捕获后文库进行LM-PCR扩增和纯化，使用Agilent Bioanalyzer 2100仪器(美国Agilent公司)对测序文库的DNA样本进行检测，再按照捕获文库DNA样本浓度及测序深度要求，应用NEXTSEQ500测序仪(美国Illumina公司)上机测序。用Sanger法对患者样本进行测序验证。

1.2.2读序原始结果生物信息学处理二代测序后产生的原始图像经Illumina Pipeline软件分析，作出评估和预判。通过质量控制，去除不可靠读数，通过BWA比对软件包将读序比对至NCBI数据库参考序列上，评估外显子捕获的情况。比对后结果应用SOAPsnp进行SNP分析，用GATK Indel Genotyper软件发现目标区域的插入或缺失。将得到的突变信息与遗传性疾病致病突变数据库，如HGMD、UMD-DMD、the leiden open variation Datebase等及正常人群SNP数据库，如NCBI dbSNP数据库、HapMap数据库、Genome 1000数据库等进行关联分析。用SIFT软件通过对单氨基酸替换的改变进行功能预测，判断其是否对蛋白质功能造成不良影响，预测结果还需要结合基因与临床的关联信息进行综合分析判断。

2结果

8例患儿均因出现运动发育障碍来院检查，均发现有致病基因变异。在6例拟诊断为杜氏肌营养不良的患者中，有4例发现了致病基因DMD基因点突变，包括4个半合子变异(c.9739C>T；c.8038_8039insC；c.7217G>A；c.3532G>T)和1个内含子剪切变异(c.10785+10G>A)；2例发现大片段缺失(49～50号外显子缺失变异；45～49号外显子缺失变异)见表1、图1。在2例拟诊断肢带型肌营养不良的患者中，发现致病基因TTN基因2对复合杂合突变(c.42958A>G ，c.2310G>T ；c.53660G>A，c.25488T>G)，致病基因LMNA一个杂合突变(c.1490T>A)，见表1。上述变异中DMD基因c.9739C>T与c.3532G>T为已经报道的致病基因，其他变异均为首次发现新突变，例3中c.7217G>A为新生变异(De Novo)。

表1　　8例进行性肌营养不良患者致病基因变异情况

注：DMD为杜氏肌营养不良；LGMD为肢带型肌营养不良。突变致病预测仅对未见报道基因预测，***表示未预测。-表示无数据。

注：例1为DMDc.9739C>T；例2为 DMDc.8038_8039insC；例3为DMD c.7217G>A；例4.1为DMD c.3532G>T，例4.2为c.10785+10G>A；例7.1为TTN c.42958A>G，例7.2为TTN c.2310G>T，例7.3为LMNA c.1490T>A；例8.1为 c.53660G>A；例8.2 c.25488T>G。

图1进行性肌营养不良突变位点二代测序图

3讨论

遗传性肌营养不良症是一组主要累及骨骼肌系统的遗传性单基因病，其临床表现复杂，病情轻重悬殊，具有高度的临床异质性。如：Duchenne型(DMD)临床特点为发病早(3岁左右)，进展快，起病后10年左右即失去行走能力，预后极差，多于20岁前死于呼吸衰竭、心力衰竭或呼吸道感染；又如Emery-Dreifuss型，早期出现肘关节、颈椎挛缩，有心肌传导障碍，病情进展慢，预后相对较好，可存活至老年[3]。

遗传性肌营养不良症根据近几年来分子遗传学、免疫组织化学及超微病理学的研究结果发现，所涉及的致病基因位点众多，相同基因位点或不同基因位点所引起的临床症状可差异悬殊或极为相似，具有高度的基因异质性。本研究完成了8例患者的遗传性肌肉病125个基因检测包的基因测序，共发现了10个微小突变，2个片段缺失突变。在肢带型肌营养不良家系中，例7的TTN基因新发现c.42958A>G、c.2310G>T的复合杂合核苷酸变异，上述变异分别导致第14 320号氨基酸由Lys变为Glu(p.Lys14 320Glu)、第770号氨基酸由Gln变为His(p.Gln770His)，均为错义变异。受检者其父在位点c.2310发现G>T的杂合变异，其母该位点未见异常；受检者其母在位点c.42958发现A>G的杂合变异，其父该位点未见异常。另外，例7还伴有致病基因LMNA一个杂合新突变(c.1490T>A)，该变异导致第497号氨基酸由Ile变为Asn(p.Ile497Asn)，为错义变异。

在肢带型肌营养不良家系的例8中，新发现了致病基因TTN的2对复合杂合突变(c.53660G>A，c.25488T>G)，2对变异分别导致第17887号氨基酸由Arg变为His(p.Arg17887His)，第8496号氨基酸由Ile变为Met(p.Ile8496Met)，均为错义变异。受检者其父在位点c.53660发现G>A的杂合变异，其母该位点未见异常；受检者其母在位点c.25488发现T>G的杂合变异，其父该位点未见异常。TTN基因是肢带型肌营养不良2J型(Muscular dystrophy,limb-girdle,type 2J)的致病基因，为常染色体隐性遗传方式(AR)。对于该类遗传方式，复合杂合变异可能导致发病。在患者TTN基因所发现的复合杂合变异分别遗传自受检者其父母，父母均为杂合子，符合常染色体隐性遗传方式。

在杜氏肌营养不良例1患者的DMD基因发现c.9739C>T的核苷酸变异，该变异导致编译第3247号氨基酸Gln的密码子变为终止密码子p.Gln3247Ter)，为无义变异。该变异的致病性已有文献报道[4]，与杜氏肌营养不良相关，该变异不属于多态性变化，在人群中发生的频率极低。其母为杂合子，符合X连锁隐性遗传方式。

在例2患者的DMD基因发现新的c.8038_8039insC的核苷酸变异，该变异导致从第2680号氨基酸Arg开始的氨基酸合成发生改变(p.Arg2680fs)，为移码变异。该变异可能导致蛋白质功能受到影响。受检者其父该位点未见异常，其母该位点为杂合子。但与该变异同一位置变异c.8038C>T的致病性已经文献报道[5]。DMD基因是杜氏/贝氏肌营养不良(DMD/BMD)的致病基因，为X连锁隐性遗传方式(XR)。对于该类遗传方式，所发现的变异可能导致发病。

例3患者发现c.7217G>A的核苷酸变异，该变异导致编译第2406号氨基酸Trp的密码子变为终止密码子(p.Trp2406Ter)，从而使肽链合成提前终止，为无义变异。患者父母DMD基因均未发现上述变异，该变异为新生变异(De Novo)。

例4患者发现c.10785+10G>A的剪切变异和c.3532G>T的无义变异。其父上述位点均未见异常，其母上述位点均为杂合子。变异c.10785+10G>A的致病性尚未见文献报道，变异c.3532G>T的致病性已经文献报道，与杜氏肌营养不良相关[6]，上述变异均不属于多态性变化，在人群中发生的频率极低。

例5和例6患者发现大片段缺失，分别发生49～50号外显子缺失变异和45～49号外显子缺失变异，这与文献报道的突变区域相符，中央热区位于44～51号外显子，占70%[7-8]。例6患者的母亲和姐姐DMD基因检测也存在同样的45～49号外显子的缺失变异，其母和姐姐很可能均为致病变异携带者。DMD病历中散发病例较多，它可能是因为：(1)隐匿传递的致病基因的“暴露”；(2)母亲卵细胞减数分裂的“差错”；(3)母亲生殖腺细胞有丝分裂差错，卵巢中有相当一部分卵母细胞携带变异基因，即“生殖腺嵌合”。

虽然现在已将基因测序检测列入遗传性肌营养不良的诊断指标之一,但目前所用的检测方法还存在许多不尽人意的地方。在准确率方面，Sanger测序法是世界公认的最准确的检测方法，可以达到100%。但由于Sanger测序法测序流程复杂，对于没有明确候选基因和候选基因数目较大的大样本病例筛查是难以完成的。另外，此法不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变类型对于与此相关的遗传性疾病还不能做出基因学诊断。

BestSeqTM是在第二代基因测序的基础上研发的新一代致病基因检测技术。在样品制备阶段，应用具有实用新型专利的独特技术设计的样品制备试剂盒，根据致病基因突变特点及序列特征，结合本实验室自主研发的探针优化设计方案，在试剂盒内设计了独特的高密度特异性捕获探针，保证了高精度、高准确率的定点靶向捕获；提高样品捕获通量通过独特的多重标签技术，给每个待检样品打上了“条形码”，可以准确稳定的一次捕获多个样品的全部待检基因。利用这一技术创新，与世界同类技术如SMRT测序方法相比，BestSeqTM致病基因检测技术可以在相同的时间能够准备最多的待检样品；对手工操作过程建立了标准化质量控制程序，有效保障检验质量的稳定性和可重复性，结合独特的高密度叠瓦式探针及多重标签技术可以将高通量测序平台的数据通量大优势发挥到极致，大大提高检测效率，可以达到一次上机同时检测300个样品，平均测序深度可以达到200X，目标捕获能力可以达到99.9%，测序精确度可以达到99.99%，而成本大大降低；同时，使用该技术，对每一个样本最多可以做到同时完成对100余种疾病的所有已知致病基因的全部位点(约50万个位点)的检测。从而使BestSeqTM致病基因检测技术成为一项可以应用于临床检验的稳定、高效的标准化检测技术。

综上所述，BestSeqTM致病基因检测技术具有很好的准确性、经济性和高效性。

参考文献

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[5]Tuffery-Giraud S,Saquet C,Chambert S,et al.The role of muscle biopsy in analysis of the dystrophin gene in Duchenne muscular dystrophy:experience of a National referral centre[J].Neuromuscul Disord,2004,14(10):650-658.

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作者简介：李宗杰，男，主管检验技师，主要从事临床检验研究。 △通讯作者，E-mail：gongcuijin@yahoo.com.cn。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.013

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)14-1933-03

(收稿日期：2016-02-17修回日期：2016-04-28)

Application of BestSeqTMtechnology in the genetic mutation detection of progressive muscular dystrophy

LIZongjie1,2,GONGCuicui1,2△,JINXingxing3,DAIWen2

(1.ScientificResearchCenter,ThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou，Henan450000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,153HospitalofPLA,Zhengzhou,Henan450042,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,.GeneralHospitalofHenanArmedPoliceCorps,Zhengzhou,Henan450000,China)

Abstract:ObjectiveTo apply the BestSeqTMnew generation pathogenic gene detection technology to perform the genetic detection in the patients with progressive muscular dystrophy(PMD) validating its sensitivity and specificity.MethodsThe BestSeqTMnew generation pathogenic gene detection technology was used to perform the gene sequencing in 2 cases of limb-girdle muscular dystrophy(LGMD) and 6 cases of Dunchenne′s muscular dystrophy(DMD),and the found point mutations were confirmed by the Sanger sequencing method.ResultsThis study completed the genetic detection in above 8 cases,2 cases of large fragment deletion and 10 cases of micromutations were detected,in which 8 micromutations were the new mutation discovered ffor the first time and verified by the Sanger sequencing.ConclusionThe BestSeqTMnew generation pathogenic gene detection technology greatly increases the detection efficiency by using the high density imbricate type probe and multiple tag technology,and has the better clinical application prospects.

Key words:progressive muscular dystrophy;genetic testing;micromutation