张　韬，陈冬冬，翁　艳，冯尔宥，张怡元*

(1.厦门大学附属福州第二医院骨科研究所，2.厦门大学附属福州第二医院骨科，福建福州350007)



白花蛇舌草中多糖抑制骨肉瘤的作用机制

张韬1，陈冬冬2，翁艳2，冯尔宥2，张怡元2*

(1.厦门大学附属福州第二医院骨科研究所，2.厦门大学附属福州第二医院骨科，福建福州350007)

摘要：为探讨白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)活性成分对骨肉瘤的作用及其机制，对白花蛇舌草中分别提取的黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类化合物，用噻唑蓝(MTT)法检测不同提取物对MG-63细胞活性的影响；同时建立裸鼠骨肉瘤移植瘤模型，观察不同提取物对移植瘤生长的抑制作用；并通过流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化，蛋白质免疫印记(Western blot)检测Bax及Bcl-2蛋白表达水平.结果显示：4种提取物都对MG-63细胞的增殖具有明显抑制作用，并呈现明显的剂量依赖性，最优药物质量浓度为80 μg/mL；在此质量浓度下4种提取物对裸鼠移植骨肉瘤均具有抑制作用，其中多糖类对MG-63细胞活性和移植瘤生长的抑制作用最强，明显促进MG-63细胞凋亡，阻滞细胞周期；Bax表达量在48 h内随着白花蛇舌草多糖类提取物作用时间延长而增加，而Bcl-2表达量则降低.由上述结果可知，白花蛇舌草活性成分中多糖类的抗肿瘤活性最强，其作用机制可能是通过抑制骨肉瘤细胞增殖、促进细胞凋亡和阻滞细胞周期来达到抑瘤效果.

关键词：白花蛇舌草；骨肉瘤；凋亡

骨肉瘤是青少年中最常见的原发恶性骨肿瘤，肿瘤恶性程度高，预后差，给家庭和社会带来极大负担.目前，手术是骨肉瘤最有效的治疗方法，但肉瘤位置特殊、术后易转移和手术费用高等均是影响患者治疗的因素，因此寻找其他经济、安全的保肢治疗方案尤为重要.白花蛇舌草(Hedyotisdiffusa，HD)属茜草科耳草属植物，具有清热解毒、消痛散结、利尿消肿、抗菌消炎、免疫调节及抗癌的功效，是用于治疗肺癌、胃癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌、淋巴瘤等癌症的中药复方中常用的单味药[1-2]，但其在治疗骨肉瘤中的作用鲜有报道.研究发现，HD水提取物、乙酸乙酯萃取物、醇提取物都具有抗肿瘤作用，其有效成分有黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类等[3].本研究首先通过体外实验筛选HD有效成分中抑制骨肉瘤细胞株MG-63增殖最明显的成分，然后通过建立裸鼠移植瘤模型，观察HD有效成分对移植瘤生长以及骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响，并初步探讨其作用机制.

1材料与方法

1.1材料

人骨肉瘤MG-63细胞株(南京科佰生物科技有限公司)，BALB/C裸鼠(体质量(18±2) g，吴氏实验动物中心)，HD黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类提取物(福州大学中药研究所馈赠)，胎牛血清(FBS,Hyclone，美国)，DMEM培养基(Hyclone，美国)，噻唑蓝(MTT，Sigma，美国)，RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒和UltraECL 底物化学发光检测试剂盒(Invitrogen，美国)，鼠抗人Bcl-2、Bax及内参GAPDH一抗，羊抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗(Abcam，英国)；Annexin-FITC-PI细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技有限公司).

1.2细胞培养

将MG-63细胞接种于细胞培养瓶中，加入含10%(体积分数，不同)FBS的DMEM培养基，置于37 ℃、5%(体积分数)CO2的培养箱中培养，每48 h传代1次，取对数生长期的细胞用于后续实验.

1.3MTT法

细胞生长至对数期后胰酶消化，培养基重悬，96孔板中每孔加入200 μL细胞悬液(细胞数约5×103).加入20 μL HD提取物(黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类)，终质量浓度为10，20，40，80，160 μg/mL，生理盐水作阴性对照，相同终质量浓度顺铂作阳性对照，每组重复6孔.培养约24 h，待细胞贴壁后弃培养基，每孔加入20 μL MTT(终质量浓度为5 mg/mL)，继续培养4 h；弃上清，每孔加入160 μL 二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，待结晶紫完全溶解后用酶标仪测定492 nm下吸光值(A)，计算细胞生存率，生存率=(A实验-A阴性对照)/(A阳性对照-A阴性对照)×100%.

1.4骨肉瘤裸鼠模型的建立

细胞培养至对数期后调整密度至5×107mL-1.充分麻醉裸鼠后，无菌操作台上在裸鼠右后肢胫骨上端行10 mm纵切口，剪开皮肤，暴露胫骨上端；用1 mL注射器缓慢钻入胫骨结节和胫骨内侧髁之间的骨皮质，穿透后拔出.用微量注射器向胫骨髓腔中注入0.2 mL准备好的细胞悬液(细胞数约1×107)，边注射边回抽针头，注射完后用5-0#缝线关闭切口.术后SPF级独立送回风净化笼中饲料并观察成瘤情况.

1.5动物分组及给药

荷瘤裸鼠随机分为5组：黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类处理组[3]，采用隔日灌胃给药，给药剂量为50 mg/kg；对照组，隔日给予同等剂量生理盐水灌胃.20 d后处死裸鼠，剥离移植瘤，称质量，取平均值.

1.6流式细胞仪检测细胞凋亡及周期

细胞培养至对数期后调整密度为1×106mL-1，接种于细胞培养瓶，5% FBS的DMEM培养基中继续培养24 h；更换无血清的DMEM培养基同步化培养24 h；最后更换为5%FBS的DMEM培养基，并加入终质量浓度为80 μg/mL的多糖类提取物，分别培养24和48 h.收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后用预冷的70%(体积分数)乙醇固定，4 ℃过夜；离心去除固定液，PBS洗涤1次，收集的细胞加入预先配好的碘化丙啶(PI)溶液，室温避光染色30 min，流式细胞仪检测.

1.7蛋白质免疫印记(Western blot)

细胞加药分别培养0，6，12，24，48 h后收集细胞并裂解，取样品裂解液进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，用含5%(质量分数)脱脂奶粉的吐温(TBST)溶液封闭1 h；洗膜后将封闭后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜与一抗4 ℃孵育过夜；洗膜后在室温条件下与二抗(1∶5 000稀释)孵育1 h；洗膜后加入底物化学发光试剂，显影、洗片、晾干.用凝胶图像分析仪扫描照片，并采用灰度分析软件ImageJ 1.48u计算各蛋白条带的灰度值.

1.8统计学分析

统计学软件为SPSS 13.0，数据表示为平均值±标准差，两样本均数比较采用t-检验，p<0.05认为差异显著.

2结果

2.1HD提取物对MG-63细胞活性的影响

如图1所示，HD的4种主要提取物(黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类)都对MG-63细胞的增殖具有抑制作用，随着药物质量浓度增加，细胞生存率越低，呈现明显的剂量依赖性，但当药物终质量浓度升高至160 μg/mL时，细胞生存率与80 μg/mL时相比差异不显著(p>0.05).其中，多糖类对MG-63细胞的生长抑制作用最明显，半抑制质量浓度(IC50)为42.5 μg/mL，在药物终质量浓度为20，40，80，160 μg/mL时，细胞生存率分别为64.5%，52.1%，34.7%和32.2%，都显著低于黄酮类、三萜酸类和香豆素类(p<0.05)，但显著高于阳性对照(p<0.05).

图1　HD提取物对MG-63细胞活性的影响Fig.1The effects of HD extracts on activity of MG-63 cells

2.2HD提取物对移植瘤的影响

根据2.1小节实验结果，选择最优药物终质量浓度80 μg/mL作为裸鼠给药剂量.裸鼠移植瘤模型实验结果显示，所有裸鼠都成活，各药物处理组移植瘤质量(香豆素类(0.88±0.11) g、黄酮类(0.39±0.12) g、三萜酸类(0.75±0.13) g和多糖类(0.22±0.07) g)都显著小于阴性对照组(1.72±0.47) g(p<0.05)，且多糖类处理骨肉瘤后的移植瘤质量最小，显著小于三萜酸类、黄酮类和香豆素类处理组(p<0.05)(图2).

图3　HD多糖类提取物对MG-63细胞凋亡及周期的影响Fig.3The effect of HD polysaccharides on apoptosis and cell cycle of MG-63 cells

(a)HD处理后的骨肉瘤移植瘤照片(重复3次)； (b)HD处理后的骨肉瘤移植瘤质量. *表示与阴性对照比较差异显著(p<0.05)； #表示与多糖类比较差异显著(p<0.05).图2　HD提取物对骨肉瘤瘤质量抑制率的影响Fig.2The effects of HD extracts on weight inhibition rate of osteosarcoma

2.3HD多糖类提取物对MG-63细胞凋亡和细胞周期的影响

采用流式细胞仪检测HD活性成分中抑瘤效果最强的多糖类提取物对MG-63细胞凋亡和细胞周期的影响，实验结果如图3所示.药物处理24和48 h后细胞凋亡率分别为18.48%和26.96%，显著高于阴性对照组(0 h)的0.02%(p<0.05)，提示HD多糖类提取物明显促进了MG-63细胞凋亡，且随着处理时间延长，细胞凋亡率有所升高.另外，药物处理24 h后G1期、S期和G2期MG-63细胞分别为42.16%，43.34%和12.44%；加药48 h后G1期、S期和G2期MG-63细胞占分别为43.75%，42.58%和9.15%；阴性对照组G1期、S期和G2期MG-63细胞占分别为32.48%，58.39%和9.13%.该结果提示HD多糖类提取物具有阻滞细胞周期的作用，但随着处理时间延长，细胞周期阻滞效果不明显.

2.4HD多糖类提取物对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

Western blot实验结果显示：促凋亡蛋白Bax表达量在48 h内随着HD多糖类提取物作用时间延长而增加；相反，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达量在48 h内随着HD多糖类提取物作用时间延长而降低(图4).上述结果提示HD多糖类提取物具有诱导MG-63细胞凋亡的作用.

*表示与0 h相比差异显著(p<0.05).图4　HD多糖类提取物对MG-63细胞Bax和Bcl-2表达的影响Fig.4The effect of HD polysaccharides on expression of Bax and Bcl-2 in MG-63 cells

3讨论

目前公认的骨肉瘤治疗模式是“术前新辅助化疗+肿瘤手术切除+术后辅助化疗”；另外，介入治疗、冷热消融治疗、中药治疗也是骨肉瘤的辅助治疗手段；还有一些治疗方法尚处于研究阶段，如基因治疗、免疫治疗、干细胞治疗和光动力治疗等.其中，临床报道证实中药能够为骨肉瘤治疗提供有效的方法，黄金昶等[4]使用自制骨瘤消胶囊联合中药汤剂治疗22 例骨肉瘤患者就取得了较好的治疗效果.

HD抗肿瘤的活性成分有黄酮类(槲皮素、山奈酚)、三萜酸类(熊果酸、齐墩果酸)、香豆素类和多糖类等化学成分，目前临床上主要用HD多成分注射液[5]，而对其单一活性成分的抗肿瘤研究甚少.有研究表明HD可降低化疗药物引起的乳腺癌细胞毒性[6]，大量研究也发现HD可诱导前列腺癌[7]、宫颈癌[8]、肝癌[9]、肾癌[10]、结肠癌[11]、胶质瘤[12]等细胞凋亡和抑制细胞增殖，还有研究发现HD也可诱导骨肉瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖[13].

本研究发现，HD提取物中黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类都会抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖，最佳抑制质量浓度均为80 μg/mL，其中多糖类抑制效果最好，细胞生存率仅为34.7%.另外，移植瘤实验结果显示，香豆素类、黄酮类、三萜酸类和多糖类处理的裸鼠移植瘤质量都明显小于阴性对照组(p<0.05)，且多糖类处理后的移植瘤质量最小，明显小于三萜酸类、黄酮类和香豆素类(p<0.05).黄酮类、三萜酸类、香豆素对MG-63细胞的抑制作用几乎相当，但三者对裸鼠移植瘤的抑制作用却有较大差异，可能由于三者在裸鼠体内吸收和代谢存在差异.

进一步对抑瘤作用最强的多糖类提取物进行了研究，结果显示：HD多糖类提取物明显促进了MG-63细胞凋亡，且随着药物处理时间延长细胞凋亡率有所升高;同时也具有阻滞细胞周期的作用，但随着药物处理时间延长，细胞周期阻滞效果变得不明显，可能药物作用时间并不是影响细胞周期的主要因素.通过分析HD多糖类提取物对Bax和Bcl-2蛋白表达的影响，发现促凋亡蛋白Bax表达量在48 h内随着HD多糖类提取物作用时间延长而增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达量则降低，说明HD多糖类提取物一方面激活Bax的表达，一方面抑制Bcl-2的表达，共同起到促进细胞凋亡的作用.

综上所述，HD提取物中黄酮类、三萜酸类、香豆素类和多糖类都具有抗肿瘤活性，其中多糖类的抗肿瘤活性最强，其作用机制可能是通过抑制骨肉瘤细胞增殖、激活Bax表达并抑制Bcl-2表达共同促进细胞凋亡，以及阻滞细胞周期等途径发挥作用，最终达到抑制骨肉瘤的效果.

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doi：10.6043/j.issn.0438-0479.201510010

收稿日期：2015-10-16录用日期：2016-01-18

基金项目：福建省自然科学基金(2015J01358)

*通信作者：zhangyiyuan_fj@126.com

中图分类号:R 965.1

文献标志码：A

文章编号：0438-0479(2016)04-0501-05

Effect of Hedyotis diffusa Polysaccharides on Osteosarcoma

ZHANG Tao1，CHEN Dongdong2，WENG Yan2，FENG Eryou2，ZHANG Yiyuan2*

(1.Department of Orthopedics Institute，Fuzhou Second Hospital，2.Department of Orthopedics，Fuzhou Second Hospital，Fuzhou 350007，China)

Abstract:To investigate the effect of Hedyotis diffusa (HD) on osteosarcoma，the MTT assay was used to detect the effects of flavonoids，triterpene acids，coumarin and polysaccharides extracted from HD on MG-63 cell activity.Osteosarcoma xenograft model in nude mice was established to evaluate the effects of HD extracts on growth of osteosarcoma.Apoptosis and cell cycle of MG-63 cells were detected by flow cytometry，and Western blot was performed to assay the expression of Bax and Bcl-2.Results showed that these four types of HD extracts significantly inhibited the proliferation of MG-63 cells with the optimal drug concentration at 80 μg/mL，which exhibited a significant dose-dependent manner.The HD extracts also inhibited the growth of osteosarcoma under the optimal drug concentration.Wherein the HD extracts，polysaccharides showed the strongest inhibition effect both on the proliferation of MG-63 cell and the growth of osteosarcoma.Data showed that polysaccharides significantly promoted the cell apoptosis，arrested the cell cycle of MG-63 cells，up-regulated the expression level of Bax and down-regulated the expression level of Bcl-2 in 48 h treatment.Therefore，among the HD extracts，polysaccharides may have the strongest inhibition effect on osteosarcoma via the inhibition of cell proliferation，the promotion of cell apoptosis，and the arresting of MG-63 cell cycles.

Key words:Hedyotis diffusa;osteosarcoma;apoptosis

引文格式：张韬，陈冬冬，翁艳，等.白花蛇舌草中多糖抑制骨肉瘤的作用机制[J].厦门大学学报(自然科学版)，2016,55(4)：501-505.

Citation：ZHANG T，CHEN D D，WENG Y,et al．Effect ofHedyotisdiffusapolysaccharides on osteosarcoma[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(4)：501-505．(in Chinese)