李梦茹，冯滢滢，2，吴凤英，杜敬河，段　　杉

（1.华南农业大学食品学院，广东广州　510642；2.广东嘉士利食品集团有限公司，广东开平　529300；3.阳江市永昊食品有限公司，广东阳江　529536）



pH值对虾油风味成分形成的影响研究

李梦茹1，冯滢滢1，2，吴凤英3，杜敬河1，*段杉1

（1.华南农业大学食品学院，广东广州510642；2.广东嘉士利食品集团有限公司，广东开平529300；3.阳江市永昊食品有限公司，广东阳江529536）

摘要：以虾头和虾壳为原料酿制虾油，采用感官评定、氨态氮（AAN）、挥发性盐基氮（TVBN）、5-羟甲基糠醛（5-HMF）、游离氨基酸、挥发性气体成分等指标，研究了酿制过程中pH值对虾油风味成分形成的影响。结果表明，pH值越高，氨态氮、挥发性盐基氮和5-羟甲基糠醛的含量均越高；不同pH值样品的颜色、口感、鲜味、酱香和虾腥味对样品的总体风味贡献比较大；自然pH值更有利于鲜味和甜味氨基酸的生成；pH值偏低易于提高鲜味氨基酸及甜味氨基酸的含量，同时也易导致产品产生较多1-氢-吲哚，从而影响产品风味；pH值偏高有利于提高苦味氨基酸的含量，影响产品的风味和口感，但同时能降低产品中吲哚类物质的含量。综上，呈味氨基酸、吡嗪类、醛类、吲哚类和醇类对样品的总体风味贡献比较大。

关键词：虾油；风味成分；pH值；影响

虾油是我国味美价廉的一种传统调味品，尤其深受海边民众的喜爱[1]。虾油的传统制作方法主要是以海产品中价值较低的鱼或虾为主要原料，在高浓度的食盐下，伴随鱼体的内源性蛋白酶以及微生物产的蛋白酶共同作用，发酵而成的香气浓郁、色泽棕红、透亮的液体调味品。本课题组曾以虾头和虾壳为原料酿制出虾油[2]。我国传统生产虾油的方法是天然酿造法，主要分为3步。①腌制。将新鲜的虾利用海水清洗干净，然后放入陶瓷缸（一般采用底部较小、中部比较大并且口比较宽的缸）中，一般露天放置2 d后便开始加入盐进行搅拌，早晚各1次，需要1个月左右，所用总盐量为虾用量的16%～25%。②发酵。起主要作用的是阳光的曝晒，同时用早晚的搅动来增加晒热度。当发酵液成为浓黑色液体的时候，发酵结束。③炼制。发酵过程结束时，发酵液的液面上会出现一层浮油，将浮油放入锅内烧煮、去除泡沫，待煮沸后用中火继续加热0.5 h左右，冷却后取澄清汁即为虾油。

与一般的发酵型调味品类似，有很复杂的理化反应在虾油的发酵过程中发生，有很多的因素都会影响虾油的发酵，这些影响因素会对虾油的风味和品质产生直接影响。朱志伟等人[3]的研究表明，即使发酵用的原料是同一种，但采用不同的发酵方法得到鱼露的风味也会存在明显的差异。为了探究造成虾油风味差异的具体原因，本论文研究了pH值对虾油的氨态氮、挥发性盐基氮、5-羟甲基糠醛、氨基酸的组成和挥发性气体成分等的影响。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

虾头和虾壳选用南美白对虾（Penaeus vannamei Boone），永旺超市购买。

1.2仪器与设备

SPME型手柄及萃取头，上海楚定分析仪器有限公司产品；DB-5型石英毛细管柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）、TRACE GC-2000 GS-MSTM，美国Finnigan公司产品。

1.3方法

1.3.1虾油的酿制

取南美白对虾的虾头和虾壳混合物作为酿造原料，分成等量的4份，分别按照原料与水为1∶1.5的比例加水，同时每份也加入食盐进行混合，食盐的用量按照最终质量分数为20%的量来进行添加。在虾油的酿造过程中每隔12 h需要调节1次pH值，使4份样品的pH值分别维持在6.5，7.0，7.5，8.0；另一组样品不调节pH值，即处于自然pH值（其pH值介于7.5～8.0），酿制的温度为35℃。这5份样品每隔6 d进行1次测定，测定内容为5-HMF的含量和感官评定；在虾油酿制结束后，根据结果选择部分虾油样品的挥发性气体成分和游离氨基酸组成进行测定。

1.3.2游离氨基酸的分析

参照GB/T 5009.124—2003，取5 mL虾油，用水稀释10倍，于4℃条件下静置30 min，取出1 mL并加入1 mL 50 g/L的磺基水杨酸后静置1 h，再加入0.5 mL pH值为2.2的醋酸-磷酸盐缓冲液和0.5 mL 50 mg/mL的EDTA，于2 mL离心管中，以转速12 000 r/min低温离心15 min，用注射滤头取上清液并过滤转移至检测瓶。采用日立-8800型氨基酸自动分析仪进行检测。

1.3.3顶空-固相微萃取条件

在50 mL样品瓶中加入10 mL的样品，用聚四氟乙烯-硅橡胶塞封口，40℃水浴，水浴时间为20 min；然后以固相微萃取纤维CAR/PDMS 75 μm顶空萃取30 min。进样品温度220℃，解析3 min。

1.3.4气相色谱条件

色谱柱为DB-5型毛细管柱，型号为30 m× 0.25 mm×0.25 μm。柱温起始为50℃，保持起始温度1 min，然后以5℃/min升温至100℃，保持2 min，而后再按10℃/min升温至220℃，保持6 min。进样口温度为220℃，热解析3 min；载气为氦气，流量为1.0 mL/min。

1.3.5质谱条件

5975C型四级杆质谱仪，电子轰击（EI） 离子源，电子能量为70 eV；离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，质量扫描范围为35～335 m/z。

1.3.6其他测定方法

氨态氮和挥发性盐基氮分别按照GB/T 5009.39—2003和GB/T 5009.44—2003的方法进行测定；5-羟甲基糠醛参照Cohen E等人[4]的方法测定。

1.3.7感官评定方法

感官评价小组由10人组成（5男5女），并进行总时间不小于2 h的培训。对虾油样品的颜色、气味（氨味、鱼腥味、肉味、臭味、酱香味）和口感（酸味、鲜味、咸味） 在0～8分之间进行评分，其中0分代表感官评价最低，8分代表感官评价最高。

1.3.8数据统计分析

测定和分析结果采用SPSS 16.0和Excel进行数据处理。

2　结果与讨论

在虾油酿制过程中，pH值的变化主要是各种复杂生化反应相互作用的综合反映[5]。蛋白质在原料自身蛋白酶和微生物蛋白酶的共同作用下发生水解产生氨基酸、肽等；酿制中微生物将产生一些酸，同时原料中也含一些有机酸，如乳酸等；同时氧化三甲胺、氨基酸等分解产生三甲胺、氨和胺等呈碱性的成分（TVBN）；上述酿制过程中生成的各种成分均影响体系的pH值。

2.1pH值对虾油酿造过程中AAN含量的影响

AAN是衡量虾油酿制过程中蛋白质水解程度的重要标志，与蛋白酶的水解作用有关。分别控制pH值为5.0，6.0，7.0，8.0，研究pH值对虾油酿造过程中AAN含量的影响。

AAN含量随时间的变化趋势见图1。

图1AAN含量随时间的变化趋势

由图1可知，在酿制过程中，pH值为5.0～7.0时，pH值越高，AAN含量越高；pH值8.0时，AAN含量有所下降。这表明在pH值为5.0～7.0时，pH值越高，蛋白酶活力越高；随着pH值继续升高，蛋白酶活力有所下降。经方差分析得知，pH值对虾油的AAN含量有极显著性影响（p<0.01）。

2.2pH值对虾油酿造过程中5-HMF含量的影响

5-HMF含量随时间的变化趋势见图2。

图25-HMF含量随时间的变化趋势

Lopetcharat K等人[6]研究认为，虾油的褐变颜色是由美拉德反应形成的。美拉德反应的中期阶段会生成5-羟甲基糠醛（5-HMF），5-HMF的积累量与褐变的速度有着紧密的联系，5-HMF积累一定时间后就会发生褐变，因此5-HMF的积累情况可作为预测褐变速度的指标[7]。由图2可知，随着pH值的升高，5-HMF的含量也相应地变多，也就会导致褐变程度加深。当虾油发酵至24 d后，5个虾油样品5-HMF的含量基本没有大幅度的增加，这就说明美拉德反应在24 d后慢慢减弱。经方差分析得知，pH值对样品的5-HMF含量有显著性影响（p<0.05）。

2.3pH值对虾油酿造过程中TVBN含量的影响

TVBN含量随时间的变化趋势见图3。

图3TVBN含量随时间的变化趋势

TVBN的形成主要是虾头和虾壳在酿造过程中在酶和细菌的作用下发生腐败，分解蛋白质产生的氨以及胺类等碱性含氮化合物。大多数国家的法规规定，在加盐的虾油加工中，TVBN含量最大不能超过2 mg/g，但我国对此未做相关规定。由图3可知，在酿制过程中，pH值越高，TVBN含量越高。这表明在碱性条件下TVBN更易于产生。可能pH值越高，某些腐败微生物得不到抑制；同时pH值越高，AAN含量越高，使腐败微生物分解的底物增加，这都会导致TVBN含量的增加。经方差分析得知，pH值对虾油的TVBN含量有显著性影响（p<0.05）。

2.4虾油酿造过程中感官评定的结果

酿制开始时的感官评定结果见图4，酿制结束时的感官评定结果见图5。

图4　　酿制开始时的感官评定结果

图5　　酿制结束时的感官评定结果

由图4和图5可知，对于不同pH值的虾油样品而言，起着较大贡献作用的是颜色、口感、鲜味、酱香和虾腥味；自然pH值和pH值7.5样品的氨味比较浓，pH值6.5样品的则比较淡；对于肉味和鲜味，自然pH值和pH值8.0样品的差别比较明显，pH值8.0样品的比较浓；pH值6.5样品的酱香味比较浓，而pH值8.0的比较淡；pH值8.0和pH值7.5样品的虾腥味比较浓，其次是pH值7.0和自然pH值样品，最淡的是pH值6.5的样品；另外pH值8.0样品的酸味比较强烈，而其他样品的则比较淡。

2.5pH值对虾油酿造过程中游离氨基酸的影响

根据上述感官评定的结果以及氨态氮、挥发性盐基氮和5-羟甲基糠醛含量的变化，在研究pH值对样品酿制过程中游离氨基酸含量的影响时，选取了在自然pH值和pH值8.0条件下酿制的样品来作为分析检测对象。

酿制过程中pH值控制对游离氨基酸含量的影响见表1。

虾油中的呈味物质主要由呈味氨基酸决定。由表1可知，与pH值8.0下酿制的样品做比较，自然pH值下酿制样品的鲜味氨基酸、甜味氨基酸以及氨基酸总量均比较高，但苦味氨基酸的含量则稍低。自然pH值和pH值8.0下酿制样品的氨基酸均比酿制前有大幅度增加，这表明自然pH值更有利于鲜味和甜味氨基酸的生成，而pH值偏高则容易产生苦涩味，影响产品的风味和口感。

表1　　酿制过程中pH值控制对游离氨基酸含量的影响

富含甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸4种氨基酸和牛磺酸是甲壳类动物的特征。自然pH值和pH值8.0下酿制样品的牛磺酸和精氨酸都在减少，其中pH值8.0下酿制样品的减小幅度较大，这表明pH值越高，越不利于牛磺酸和精氨酸的生成；羟脯氨酸是脯氨酸羟基形式，可以通过脱羟基生成脯氨酸，由表1可知，自然pH值下酿制样品的羟脯氨酸和脯氨酸含量都有所增加，而pH值8.0下酿制样品的羟脯氨酸和脯氨酸含量则都有所减小，这表明自然pH值更加有利于羟脯氨酸和脯氨酸的生成。

瓜氨酸是动物体内氨基酸代谢尿素循环的中间产物，鸟氨酸由精氨酸降解脱去尿素而产生，二者均是尿素循环的中间产物。乙醇胺在室温下有吸湿性和氨臭，是样品腐败产生的不良风味物质，由表1可知，2个样品的瓜氨酸和鸟氨酸、乙醇胺含量均比酿制前有所增加，并且自然pH值下酿制样品的瓜氨酸和鸟氨酸、乙醇胺增加的总量比pH值8.0下酿制样品的高。

2.6pH值对虾油酿造过程中挥发性气体成分的影响

根据上述感官评定的结果以及氨态氮、挥发性盐基氮和5-羟甲基糠醛含量的变化，在研究pH值对样品酿造过程中挥发性气体成分的影响时，选取了在自然pH值和pH值8.0条件下酿制的样品来作为分析检测对象。

酿制过程中pH值控制对样品的气体成分影响见表2。

由表2可知，酿制前的样品中气体成分种类较少，其中醇类和烷烃类占主要部分，分别为61.63% 和25.27%。自然pH值和pH值8.0下酿制样品的气体，经分离鉴定，发现吲哚类、吡嗪类、烷烃类含量较多，其中自然pH值和pH值8.0下酿制样品中含量最高的均是吲哚类；pH值8.0下酿制虾油样品的吡嗪类含量远高于自然pH值下酿造的虾油样品的含量；将在自然pH值和pH值8.0下酿制的样品与酿制前样品中的气体组成相比，会发现在这2种酿制的样品中含有大量的吲哚类和吡嗪类物质，并且这些样品中的醇类物质明显减少，这表明虾油样品在酿制过程中能产生大量吲哚类和吡嗪类物质；其他气体成分的含量相差不大。总的来看，吡嗪类、烷烃类、醛类、吲哚类对样品的总体风味有较大的作用。

研究发现，虾风味主要由吡嗪、酮、醇、醛、嘧啶、有机酸等化合物组成，其中吡嗪类物质是对虾风味贡献最大的物质，其呈味域值较小，可以增加产品的香气。例如，四甲基吡嗪、三甲基吡嗪具有虾油的独特风味，可能对虾油酱醇厚风味的形成有直接影响[8]。

Yeo H C H等人[9]研究表明，吡嗪的产生是氨基亲核进攻羰基，通过加成反应和脱水反应来完成。从这个机理来讲，体系pH值对吡嗪类物质的产生起着决定性作用，因为羰基和氨基随着体系氢离子浓度的变化进行不同程度的离子化，而这些基团的离子化非常关键。羰氨缩合具有pH值依赖性，是吡嗪形成的第一步，也是非酶褐变的限速步骤且美拉德反应速率随介质pH值的升高而增大[10]。本文研究自然pH值和pH值8.0对虾油风味影响时，发现pH值8.0下酿制样品中吡嗪类物质的含量远远高于自然pH值的，所鉴定出的吡嗪类化合物与前人所做研究相似[11]，而且部分也是典型的美拉德反应产物。

表2　　酿制过程中pH值控制对样品的气体成分影响

根据自然pH值和pH值8.0下酿制样品的游离氨基酸和气体的酿制前变化情况，可以发现pH值偏低容易产生呈味氨基酸，pH值偏高则容易产生吡嗪类物质，这类物质是美拉德反应的中间产物，对产品的风味贡献比较大。这表明呈味氨基酸与气体成分有密切的联系，pH值偏高，美拉德反应进程越快，消耗的氨基酸越多，但产生的其他物质也越多；二者达到平衡时，产品的总体品质达到最佳。

3　结论

pH值偏低，易于提高鲜味氨基酸及甜味氨基酸含量，同时也易导致产品产生较多的1-氢-吲哚，影响产品的风味；pH值偏高，有利于提高苦味氨基酸含量，降低产品中的吲哚类物质。总的来看，呈味氨基酸、吡嗪类、醛类、吲哚类和醇类对样品的总体风味贡献比较大。

参考文献：

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[4]Cohen E，Birk Y，Mannheim C H，et al.A rapid method to monitor quality of apple juice during thermal processing[J]. Lebensm.-Wiss.u.-Technol.，1998，31：612-616.

[5]冷耀宗.鱼露酿制和pH值变化规律初探 [J].中国调味品，1988，13（8）：9-10.

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[11]Kim J S，Shahidi F，Heu M S.Characteristics of Salt-fermented sauces from shrimp processing by products[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51：784-792.◇

中图分类号：TS225.24

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.06.003

文章编号：1671-9646（2016）06a-0007-06

收稿日期：2016-03-30

作者简介：李梦茹（1992— ），女，硕士，研究方向为水产品综合利用。

*通讯作者：段杉（1966— ），男，博士，副教授，研究方向为食品生物技术和水产品综合利用。

Influence of pH Value on Formation of Flavour Ingredients in Fermentation of Shrimp Sauce

LI Mengru1，FENG Yingying1，2，WU Fengying3，DU Jinghe1，*DUAN Shan1
（1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642，China；2.Guangdong Jiashili Food Group Co.，Ltd.，Kaiping，Guangdong 529300，China；3.Yangjiang Yonghao Food Co.，Ltd.，Yangjiang，Guangdong 529536，China）

Abstract：In this paper，shrimp waste is used as raw material to ferment shrimp sauce.AAN，TVBN and 5-HMF，free amino acids and volatile flavor components in combination with sensory evaluation are adopted to study the influence of different pH values on the formation of flavor ingredients in the fermentation.Results show that lower pH favored to produce more delicious and sweet amino acids，meanwhile，more 1-hydrogen indole，which is odoriferous，is formed.Higher pH favored to produce more bitter amino acids，and meanwhile，less 1-hydrogen indole is formed.In general，amino acids，pyrazines，aldehydes，indoles and alcohols contribute much to the flavor of shrimp sauce.

Key words：shrimp sauce；flavour ingredients；pH value；influence