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抗CD20单克隆抗体与IL-10基因联合应用对NOD鼠肝脏PDX-1的影响

2016-07-25

中国卫生标准管理 2016年5期
关键词:单克隆胰岛免疫组化

范 磊 李 诚 李 堂



抗CD20单克隆抗体与IL-10基因联合应用对NOD鼠肝脏PDX-1的影响

范 磊 李 诚 李 堂

【摘要】目的 察抗CD20单克隆抗体与IL-10基因联合应用于已发病的NOD鼠,观察对其肝脏中PDX-1表达的影响。方法 17-20周龄雌性发病的NOD小鼠24只,随机分为A、抗CD20单克隆抗体组(于发病第1 d尾静脉注射Anti-CD20 500 µg,并于第3、6、9 d尾静脉注射Anti-CD20 250 µg);B、抗CD20单克隆抗体+IL-10基因组(第1 d尾静脉注射Anti-CD20 500 µg + IL-10基因0.1 ml,后相同时间尾静脉注射Anti-CD20 250 µg + IL-10基因0.1 ml);C、IL-10基因组(IL-10基因0.1 ml);D生理盐水对照组(生理盐水0.1 ml)。发病后每周监测2次体重;每天同一时间监测血糖,若血糖≥25 mmol/L,按20 U/kg皮下注射来得时。观察6周后行免疫组化检测肝脏中PDX1蛋白相对表达量,并行PCR了解PDX-1基因表达情况。结果 联合治疗组肝脏中PDX-1基因表达及蛋白表达水平高于其他组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 抗CD20单克隆抗体与IL-10基因组联合干预可提高可促进PDX-1的表达。

【关键词】抗CD20单克隆抗体;白细胞介素10;胰腺-十二指肠同源框1;肝脏;1型糖尿病

Objective To observe the influence of liver PDX-1 expression in NOD mice after interfered by anti-CD20 monoclonal antibody combined with inter-leukin10. Methods Twenty-four female NOD mice(17-20weeks old)were randomly divided into four groups:A Anti-CD20,B Anti-CD20+IL-10,C IL-10 and D Normal Control(NC)groups. The first time group A and B were respectively injected of 500 µg Anti-CD20 antibody,combined 500 µg Anti-CD20 antibody. After the 3、6、9 day,group A、B、C、D were injected of 250 µg Anti-CD20 antibody,combined 250 µg Anti-CD20 antibody,0.1 ml IL-10 and 0.1 ml physiological saline. All mice were twice weekly monitored for weight,and monitored for blood glucose at the same time everyday. After 6weeks,the local expression of PDX-1 were observed by immunohistochemistry. The gene expression of PDX-1 were observed by PCR. Results After combined Anti-CD20 and IL-10 intervention,the liver PDX1 expression was upregulated(P<0.05).Conclusion The combined administration of Anti-CD20 and IL-10 increased increased the expression of PDX1 in the liver.

【Key words】 Anti-CD20 antibody,Interleukin 10,PDX-1,Liver,T1DM

1型糖尿病(T1DM)是一种严重危害青少年健康一种自身免疫性疾病,且发病率呈上升趋势。目前终生胰岛素注射治疗仍为治疗的主要手段,即使胰岛素制剂及用法不断改善,仍给患儿的生活带来很大不便,因此寻求胰岛β细胞的再生,延缓胰岛炎的进程,保护残存胰岛β细胞功能,成为研究T1DM治疗的热点之一。目前认为1型糖尿病病情进展过程与Th1/Th2失衡有关[1],且β细胞在发病过程中亦发挥着重要作用。NOD鼠因遗传学特征和免疫学特征与人类近似被认为是1型糖尿病的最佳实验模型。NOD鼠通常于4~5周开始出现胰岛炎,并进行性破坏,于12周龄时开始出现糖尿病症状,到30周龄时累计发病率可高达80%[2]。

在胚胎发育时期,胰腺和肝脏来源于相邻区域的内胚层,肝脏被认为是产胰岛素细胞的潜在来源[3]。其中胰腺-十二指肠同源框1(PDX-1)在胰腺的发育以及胰岛素分泌过程中都扮演了重要的角色。有研究发现[4]利用转分化技术,在肝实质中表达修饰过的PDX-1基因,可使肝脏细胞分化成为具有内分泌和外分泌活性的胰腺细胞。本课题组前期实验表明[5],抗CD20单克隆抗体与IL-10联合应用可以减轻胰岛β细胞的凋亡和损伤。由于肝脏对机体糖脂代谢起着重要作用,所以本实验联合应用抗CD20单克隆抗体与IL-10基因作用于NOD鼠观察其对肝脏中PDX-1表达的影响。由于IL-10半衰期极短,不适合直接应用,本课题组前期已经成功构建了携带有鼠IL-10基因的重组腺病毒载体[6],并发现其感染胰岛素分泌细胞,细胞内可有效表达IL-10。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康雌性NOD鼠24只,17~20周龄,由常州卡文斯实验动物有限公司,SPF级,饲养于青岛大学附属医院动物实验中心,12 h明暗交替,温度23℃左右,湿度60%左右,不限饮食。饲养期间每周固定时间监测随机血糖2次,随机血糖连续2次>13.9 mmol/L时,即诊断为糖尿病。

1.2 实验方法

1.2.1 重组腺病毒扩增及滴度测定 当80%左右的HEK293细胞(美国ATCC细胞库)贴壁时感染腺病毒,弃细胞原培养液,加入2 ml培养液、200 µl携有IL-10基因的重组腺病毒液,于二氧化碳培养箱中培养24~48 h,倒置显微镜下观察到>80%细胞出现绿色荧光时收获病毒液,离心弃上清,加入PBS液,反复离心、冻融后留取上清。96孔培养板中接种HEK293细胞,并根据腺病毒感染性滴度试剂盒(快速检测)说明操作,测定重组腺病毒滴度。

1.2.2 分组 将24只NOD鼠经随机分为:A、抗CD20单克隆抗体组,B、抗CD20单克隆抗体 + IL-10基因组,C、IL-10基因组,D、NC组。第1 d,组A、B经尾静脉注射的抗CD20单克隆抗体首次计量加倍为500 µg,后分别于第3、6、9 d尾静脉给予抗CD20单克隆抗体250 µg、抗CD20单克隆抗体250 µg + IL-10基因0.1 ml,IL-10基因0.1 ml、生理盐水0.1 ml,抗CD20单克隆抗体首次计量加倍。发病后每周监测2次体重;发病后每天同一时间测量血糖,血糖≥25 mmol/L,按20 U/kg皮下注射来得时。观察6周后,腹腔注射水合氯醛麻醉,将老鼠断颈处死,无菌剪剪开腹腔,分离出肝脏。

1.2.3 PDX-1 mRNA检测 采用RT-PCR法,用超纯RNA提取试剂提取组织样本中总RNA。取5 μl RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳,以检测RNA的完整性。用反转录试剂盒中的gDNA Eraser对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理。用反转录试剂盒进行反转录。PCR反应体系为:2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 µl、上游引物0.5 µl、下游引物0.5 µl、cDNA 10倍稀释后取2 μl、灭菌双蒸水4.5 µl(总体积20 µl)。PCR扩增的温度条件:95℃ 30 s,(95℃ 5 s,60℃ 34 s)×40个循环。引物序列:上游:5,-GGAGGAGAATAAGAGGAC-3,,下游:5,-GAACCAGATTTTGATGTG -3,,PCR产物为154 bp。内参序列:上游:5,-CGTATCGGACGCCTGGTT-3,,下游:5,-GTGCCGTTGAACTTGCCG-3,,PCR产物为140 bp。取5 μl RNA,用1%琼脂糖凝胶进行电泳,根据Real-Time PCR原始检测结果,按照2-△△ct相对定量计算公式,计算出各样品的目的基因相对定量结果,即其他各个样品相对于对照样品,目的基因mRNA转录水平的差异

1.2.4 免疫组化检测肝脏中PDX-1的相对量的表达 将肝脏石蜡切片依次行抗原修复、灭活酶、封闭、抗原-抗体反应、加增强剂、一抗二抗反应、显色、终止显色、复染、脱水封固等系列操作后于光学显微镜下观察组织细胞中的表达情况。选取5个高表达区域拍照保存。阳性细胞为胞浆内有棕黄色颗粒沉积。评分标准:A为阳性细胞数分级0%~1%=0、1%~10%=1、10%~50%=2、50%~80%=3、80%~100%=4;B为阳性细胞显色强度分级0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性)。IHS=A×B[8]。

1.2.5 统计学方法 实验数据用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以(x-±s)表示,对数据进行正态性检验及方差齐性检验,对不符合正态性检验的数据予数据转化,多组间数据比较采用方差分析和LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脏免疫组化检测PDX-1表达水平

与对照组相比,Anti-CD20组、Anti-CD20+IL-10组、IL-10 组PDX-1蛋白表达均较高,且P<0.05,有统计学意义;与Anti-CD20组相比,IL-10组、Anti-CD20+IL-10组PDX-1基因表达较高,且P<0.05,有统计学意义;但Anti-CD20+IL-10组与IL-10组相比较无统计学意义。PDX-1免疫组化染色产物位于胞浆,呈棕褐色颗粒,(具体见图1、表1)。

图1 Anti-CD20与IL-10联合治疗对NOD鼠肝脏PDX-1表达水平的影响(免疫组化染色,×400)

表1 各组免疫组化肝脏PDX-1的相对量的表达(±s,mmol/L)

表1 各组免疫组化肝脏PDX-1的相对量的表达(±s,mmol/L)

注:与NC组相比,*P<0.05;与Anti-CD20组,#P<0.05;与IL-10组,△P>0.05

组别 鼠数 PDX-1 Anti-CD20组Anti-CD20+IL-10组IL-10组NC组6666 42.5±14.167*117.5±11.912*#△118.5±10.173*#11.8±3.601

2.2 Real-Time PCR检测肝脏中PDX-1基因表达量

与对照组相比,Anti-CD20组、Anti-CD20+IL-10组、IL-10 组PDX-1基因表达均较高,且P<0.05,差异有统计学意义;较Anti-CD20组、IL-10组,联合组PDX-1基因表达较高,且P<0.05,差异有统计学意义;但Anti-CD20组与IL-10组相比较差异无统计学意义,(具体见表2,图2)。

表2 各组PCR检测肝脏PDX-1基因表达量(±s,mmol/L)

表2 各组PCR检测肝脏PDX-1基因表达量(±s,mmol/L)

注:与NC组相比,*P<0.05;与Anti-CD20组,#P<0.05;与IL-10组,△P>0.05

组别 鼠数 PDX-1 Anti-CD20组Anti-CD20+IL-10组IL-10组NC组6666 1.319±0.242*1.727±0.202*#△1.307±0.243*0.706±0.346

图2 PCR检测肝脏PDX-1基因扩增曲线

3 讨论

1型糖尿病是在多种遗传因素和环境因素相互作用下,引发自身免疫功能紊乱,导致胰岛β细胞进行性损伤和胰岛素分泌绝对不足为基础的自身免疫性疾病。人们普遍认为辅助性T淋巴细胞在1型糖尿病的发病中起中心性作用,Th1/Th2细胞亚群的失衡是该病发病的关键[9]。IL-10主要由Th2细胞分泌,作为一种多效性细胞因子,具有抗炎及免疫抑制特性,可抑制自身免疫反应过程中炎性因子释放,抑制抗原提呈等多个环节,并可促进β细胞分化[10]。实际上β细胞在1型糖尿病的发生及发展过程中也起着重要作用。最近有研究表明存在β细胞缺陷的NOD鼠给予抗体治疗后,NOD小鼠不会发生胰岛炎及1型糖尿病[11]。CD20 是β细胞细胞膜表面特异性的细胞因子之一,它表达于pre-β细胞阶段,并参与β细胞活化过程。抗CD20单克隆抗体是针对β淋巴细胞表面CD20分子的单克隆抗体,能够与细胞表面CD20分子高亲和力结合,可导致被结合的β淋巴细胞清除,使体内β淋巴细胞的数量减少[12-13]。2009年11月公布的一项Ⅱ期临床实验中表明,应用抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)可使β细胞耗竭,在1年内胰岛素需求量和HbA1c比对照组降低[14]。但是由于抗CD20单克隆抗体对体内β淋巴细胞的清除作用,使得机体在一定时期内β淋巴细胞的数量维持在较低水平,从而对免疫功能造成一定的影响。最近就有研究指出,消除调节性β细胞可引起溃疡性结肠炎急性发作,与局部IL-10产生降低有关[15]。本课题组前期研究发现,IL-10通过抑制β细胞表面Fas表达而起到抗凋亡作用[15]。将IL-10与CD20单克隆抗体联合使用,尽可能规避抗CD20单克隆抗体的副作用。

肝脏是三大物质代谢的主要场所,也是胰岛素作用的三大脏器之一,且胰岛素又反馈性调节肝脏的糖脂和氨基酸的代谢方向,因此糖尿病肝脏胰岛素信号通路的改变可能是肝脏参与糖尿病发病机制的重要方式。在胚胎发育至第4周时,形成原始肠管,即前肠、中肠和后肠。在前肠尾端腹侧靠近卵黄囊管处,内胚层增厚,称肝憩室,即肝和胆道的原基。由于胰腺和肝脏均来源于相邻区域的内胚层,肝脏被认为是产胰岛素细胞的潜在来源[3]。人们早在发生肝硬化的肝脏组织中发现了类似胰腺外分泌细胞的腺泡细胞,间接证明了肝脏向胰腺自然转化的存在。肝脏内有类胰腺内分泌前体细胞,可以表达与胰腺内分泌细胞发育相关的胰岛素转录因子如PDX-1,ngn3等。PDX-1大多分布于产胰岛素的β细胞及分泌生长抑素的δ细胞中,也散在分布于十二指肠和发育的脑中的一些内分泌细胞中。PDX-1在胰腺的发育中有重要作用,它是胰腺发育必需的转录因子,在内分泌腺前体细胞分化为胰岛β细胞过程中起着关键作用。有研究表明在PDX-1基因敲除的小鼠中,未发现成熟的胰岛细胞,生后很快发生高血糖症[16]。本课题组前期实验发现,将抗CD20单克隆抗体与IL10联合应用,可降低NOD鼠的血糖[5,7],遂本实验中通过PCR检测肝脏PDX-1基因表达及免疫组化检测PDX-1蛋白的相对表达量,发现联合应用可促进肝脏中PDX-1的表达,这或者为外源性胰岛素的产生提供新的研究途径。

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Effect of Combined Application With Anti-CD20 Antibody and Interleukin-10 Gene on Liver PDX-1 Expression in NOD Mice

FAN Lei LI Cheng LI Tang Qingdao University,Qingdao 266071,China

【Abstract】

【中图分类号】R3

【文献标识码】A

【文章编号】1674-9316(2016)05-0196-04

doi:10.3969/j.issn.1674-9316.2016.05.143

作者单位:266071 青岛大学

通讯作者:李堂,E-mail:drlitang@hotmail.com

基金项目:国家自然科学基金(项目编号:81170762)

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