林杉杉+鲍相渤+刘忠颖+王超+杨慧花

摘要：利用通用引物成果扩增了远东偏顶蛤核糖体DNA第二转录间隔区序列，并对其进行了一致性比对和系统进化分析，结果表明：远东偏顶蛤ITS2序列全长共245 bp，四个个体的序列无差异。与其他物种相比，与远东偏顶蛤一致性最高的物种为同属的偏顶蛤，系统进化树中，远东偏顶蛤与同属的其他两个种聚为一支。本文研究结果为该种的遗传进化及多样性研究提供了基础数据。

关键词：远东偏顶蛤；ITS2；系统进化

远东偏顶蛤Modiolus kurilensis F.R.Bernard，1983 是广泛分布于中日韩俄海域的大型双壳贝类，隶属于瓣鳃纲、贻贝目、贻贝科、偏顶蛤属，由于其形态学特征与来自欧洲的偏顶蛤 Modiolus modiolus （Linnaeus，1758） 模式标本非常近似，致使很多人误将远东偏顶蛤当成偏顶蛤。2014年作者通过线粒体COI基因分析，确认大连黄海北部所得标本为远东偏顶蛤[1]。

真核生物核糖体 DNA （rDNA） 在染色体上的排列顺序为 18S、5.8S、28S rDNA，其中18S与5.8S rDNA之间存在着一个转录间隔区被称为第一转录间隔区（ITS1），而5.8S与28S rDNA之间的间隔区被称为第二转录间隔区（ITS2）。两个转录间隔区与18S 、5.8S 和 28S rDNA 一起在基因组中组成多拷贝转录单元。其中两个转录间隔区由于不加入成熟核糖体，进化过程中的选择压力小，进化速度较快，因而用于多种生物的进化关系构建、遗传变异、近似种类的区分及杂交种的鉴定[2-5]。本文首次测定并报道了远东偏顶蛤大连群体的ITS2 序列全长，并与近缘物种进行了初步比较分析，旨在为该种的系统发育、遗传多样性及遗传结构研究提供基础数据。

1材料与方法

1.1实验材料

本文所用实验材料于2015年8月采自辽宁省大连市付家庄海域。个体解剖后，取闭壳肌保存于95%乙醇溶液中。

1.2试验方法

剪取适量样本，去离子水浸泡以去除乙醇，采用TIANamp Marine animals DNA kit进行基因组DNA提取。

两个转录间隔区的PCR扩增引物序列分别为ITS-2A/ITS-2B：5' –GGGTCGATGAAGAA CGCAG -3' / 5' -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3'[6]。PCR扩增体系为：TaKaRa LA Taq（5 U/μL）0.5 μL，10×LA Taq Buffer II（Mg2+ Plus）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mM each）8 μL，DNA模板50 ng，正反引物终浓度均为1.0 μM。PCR扩增程序为：94 ℃预变性 2 min；33 个循环包括94 ℃/30 s，52 ℃/30 s，72 ℃/1 min；最终72 ℃/5 min 延伸。扩增所得片段经琼脂糖电泳检测后送交上海生工行克隆测序。

从GenBank中下载贻贝科中其他物种的ITS2序列，去掉两端5.8S及28S序列，用于比较分析，用DNAMAN计算远东偏顶蛤与其他物种ITS2序列的一致性，以虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）的ITS2序列为外群，采用PHYLIP软件以邻位相连法（neighbor joining） 进行系统发育树（bootstrap=1 000）。

2结果与讨论

2.1远东偏顶蛤ITS2序列

本实验共进行了四个个体的ITS2 PCR扩增，扩增得到的片段约500 bp（图1），经克隆测序，去除片段两端的5.8S及28S序列，得到长度为245 bp的ITS2全序列，四个个体扩增片段序列完全一致，碱基序列及长度无多态性（图2）。

2.2远东偏顶蛤与其他物种ITS2序列的比较

利用DNAMAN计算了远东偏顶蛤与贻贝科其他物种及虾夷扇贝ITS2序列的一致性，结果列于表1。结果显示：贻贝科内物种ITS2长度在242-386bp之间，与远东偏顶蛤一致性最高的物种为其同属的的两个物种，其中Modiolus modiolus与远东偏顶蛤相比仅有3个碱基的缺失和3个碱基的突变。虽然贻贝Mytilus_edulis与远东偏顶蛤同属一科，然而其ITS2一致性小于非同科的虾夷扇贝，可能是由于贻贝的ITS2序列过长，导致了其与远东偏顶蛤序列一致性的严重降低。

ITS2在进化过程中选择压力较小，致使其长度及序列差异不仅存在于种间，还存在于同种的不同种群、同群体的不同个体间，甚至同一个体也存在碱基的突变[7]。喻达辉等在研究珠母贝属 6个种的 ITS 2分子标记时曾发现同种不同个体间存在少数碱基突变现象[8]。本研究虽然尚未发现个体间ITS2碱基的差异，但由于本实验仅以一个群体的四个样本为材料，不能武断地认为该种ITS序列中不存在差异。

2.3贻贝科ITS2系统进化树的构建

在利用上述ITS2序列构建的系统进化树中，同属的物种基本分布于同一姊妹分支上，东方偏顶蛤与同属的Modiolus modiolus 和Modiolus rectus聚为一支，而贻贝与同一亚科的Perna属的两个物种也分布在较近的分支上（图3）。虽然个别分支置信度仅为60%，但其显示出的进化关系与传统的形态学分类结果保持一致。上述系统进化树显示了该科进化的总体趋势：贻贝科进化分大分支，以贻贝亚科为代表的为一大分支，而另一分支则以偏顶蛤亚科代表。这一结果与Distel[9]使用18S序列研究该科进化的结果相似。

图3基于ITS2序列构建的NJ进化树

作者曾经利用东方偏顶蛤ITS1序列进行进化树构建，发现无论长度还是碱基顺序，不同物种ITS1均显示出很大的差异，以此构建的进化树与已有的分类系统大相径庭，差异很大，而本文用ITS2序列构建的系统进化树则与现有分类系统吻合的较好。孟学平等[10]曾经使用ITS2序列构建了蛤蜊科 3 种贝类的系统进化树，其显示的进化关系与使用16S序列构建的相似。综上所述，与ITS1相比，用ITS2构建的进化树能更好地反映近缘物种的进化关系。

参考文献：

[1] LIU Weidong，HE Jing，BAO Xiangbo.Mitochondrial DNA Supports the Validity of Modiolus kurilensis F.R.Bernard，1983.Shell Discoveries [J]，2014 （3）： 18-19

[2] Weekers PHH，De Jonckheere FJ，Dumont HJ.Phylogentic relationships inferred from ribosomal ITS sequences and biogeographics patterns in representative of the genus Calopteryx （Insecta： Odonata） of the West Mediterranean and adjacent west European zone [J].Mol Phyl Evol，2001，20： 89-99

[3] Chilton NB，Newton LA，Beveridge I，Gasser RB.Evolutionary relationships of trichostrongyloid Nematodes （Strongylida） inferred from ribosomal DNA sequence data [J].Mol Phyl Evol，2001，19： 367-386

[4] 孙桂金，潘杰，刘可春，等.2011.毛蚶、泥蚶和魁蚶 ITS1 核苷酸序列分析[J].生物技术通报，2011（7）：117-120

[5] 龚理，徐晖，李军，等.褐牙鲆（♀）、夏鲆（♂）及其杂交子一代的 ITS1 序列特征分析[J].中国水产科学，2015，22（1）： 17-23

[6] Hedgecock D，Li G ，Banks M A，et al.Occurrence of the Kumamoto oyster Crassostrea sikamea in the Ariake Sea，Japan [J] .Marine Biology.1999，133（1）：65-68.

[7] 唐伯平，周开亚，宋大祥.核rDNA ITS 区序列在无脊椎动物分子系统学研究中的应用[J].动物学杂志，2002，37（4）：67-72

[8] 喻达辉，朱嘉濠.珠母贝属6个种的 ITS 2分子标记研究[J].南方水产，2005，1（4）：6-12.

[9] Distel DL.Phylogenetic Relationships among Mytilidae （Bivalvia）： 18S Rrna Data Suggest Convergence in Mytilid Body Plans [J].Molecular Phylogenetics and Evolution.2000，15（1）：25–33

[10] 孟学平，高如承，董志国，等.蛤蜊科 3 种贝类 16S rRNA 基因片段及 ITS2 核苷酸序列分析[J].湛江海洋大学学报，2006，26（4）：8-13