王　金，赵一洁，崔广宾，尚培中△

(1.中国人民解放军第二五一医院普通外科，河北张家口 075000；2.河北北方学院，石家庄 075061)



HGF蛋白与C-Met蛋白在胆管癌中的表达及临床意义

王金1，赵一洁2，崔广宾2，尚培中1△

(1.中国人民解放军第二五一医院普通外科，河北张家口 075000；2.河北北方学院，石家庄 075061)

[摘要]目的探讨肝细胞生长因子(HGF)与其受体(C-Met)蛋白在血清及组织中的表达及临床意义。方法采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测42例初治胆管癌患者及20例健康对照者血清HGF及C-Met水平；应用免疫组织化学技术观察42例胆管癌组织及正常组织HGF及C-Met的表达。结果术前1 d胆管癌患者血清中HGF蛋白与C-Met蛋白水平均高于健康对照者(1.53±0.48)ng/mLvs.(0.48±0.55)ng/mL;(16.28±5.17)ng/mLvs.(4.31±2.84)ng/mL,差异均有统计学意义(P<0.05)。术后第3天胆管癌患者血清中HGF蛋白与C-Met蛋白水平较术前变化不明显，而术后第7、10天HGF蛋白与C-Met蛋白水平较术前则明显降低。另外，HGF蛋白与C-Met蛋白在胆管癌组织的阳性表达率分别为76.2%、81.0%，在正常组织的表达分别为15.0%、20.0%。结论HGF蛋白与C-Met蛋白在胆管癌患者血清和组织中异常表达，可能与胆管癌的发生、发展有密切关系。

[关键词]胆管肿瘤；肝细胞生长因子；C-Met蛋白；临床病理特征

胆管癌(cholangiocarcinoma)是指起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，恶性程度高、预后差，根治性手术切除后患者的5年生存率也仅为20%～40%[1]。胆管癌细胞强大的局部侵犯和远处转移能力是胆管癌预后极差的两大主要危险因素。目前，胆管癌治疗效果欠佳,预后较差,逐步提升为临床研究重点之一[2]。随着生命科学及分子生物学的发展，与肿瘤转移有关的分子机制逐渐被人们发现。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)及其受体(C-Met)蛋白在人类肿瘤的发展及转移中有重要作用，但目前对于HGF和C-Met蛋白的研究还主要集中在胃癌、肝癌、肺癌等领域，在胆管癌中还鲜有报道[3-4]。本研究检测了健康者和胆管癌患者血清中HGF和C-Met蛋白的水平，并且对正常组织和胆管癌组织中HGF和C-Met蛋白的表达情况进行了分析，探讨HGF和C-Met蛋白在胆管癌中的表达和临床意义。

1资料与方法

1.1一般资料选取2012年12月至2015年3月本院普外科收治的胆管癌患者42例(胆管癌组)，男25例，女17例，年龄36～78岁，平均(59.6±13.0)岁。全部患者均接受准根治性切除手术。肿瘤大小0.4～3.8 cm。中低分化19例、高分化23例。根据2010年美国国家癌症综合网(NCAA)第7版TNM分期标准进行分类：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期20例。另选取同期健康对照者胆管正常组织20例(健康对照组)，术后存档蜡块经EliVisionTMplus免疫组织化学染色后光镜观察。

1.2实验试剂人HGF及C-Met 酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自美国Genzyme公司；兔抗人HGF和C-Met单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；EliVisionTMplus二步法试剂盒购自福州迈新生物制品有限公司。

1.3方法

1.3.1研究方法所有患者均于入院后术前1 d，术后第3、7、10天采集静脉血3 mL，室温下静置10 min后，4 ℃下2 500 r/min离心10 min收集血清保存于-80 ℃冰箱。使用人HGF ELISA试剂盒检测各样本HGF水平，检测步骤严格按照说明书进行。根据微波(microwave，MW)热效应原理，采用MW抗原修复EliVisionTMplus二步免疫组织化学染色方法，每例连续切片进行HGF和C-Met标记，每种免疫组化标记的切片染色2张，其中1张DAB显色后苏木素复染用于观察和照相，另一张不复染，用于图像分析。每次用已知HGF和C-Met阳性标本切片作为阳性对照。以磷酸盐缓冲液(PBS)溶液代替一抗做空白对照，以排除假阳性结果。

1.3.2结果判定HGF蛋白阳性着色主要位于肿瘤细胞和间质细胞胞质及细胞膜，C-Met蛋白阳性着色主要位于肿瘤细胞质及细胞膜。结果的判定遵循双盲法,由2名病理医师独立观察。染色判定结果标准：随机观察并计数10个高倍镜(×400)视野下的阳性细胞，根据细胞染色强度及阳性细胞数占同类细胞总数的百分率综合判定。

2结果

2.1胆管癌术前、术后及健康对照组血清中HGF及C-Met水平比较胆管癌组患者术前1 d血清中HGF及C-Met蛋白的表达明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。术后第3天胆管癌组患者血清中HGF蛋白与C-Met蛋白水平较术前变化不明显，而术后第7、10天HGF蛋白与C-Met蛋白的水平较术前则明显降低，甚至达到正常水平。

表1　胆管癌及健康对照组术前、术后血清中

*：P<0.05：与健康对照组比较；#：P<0.05，与胆管癌组术前1 d比较。

2.2HGF及C-Met蛋白在胆管癌组织及正常胆管组织中的表达HGF及C-Met蛋白在大部分细胞质内出现棕色阳性表达(图1、2)，胆管癌组的阳性表达率明显低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2　HGF及C-Met的在胆管癌组织及正常

A：HGF在正常胆管组织中的表达；B：HGF在胆管癌组织中的表达。

图1HGF蛋白的表达情况(Envision，×100)

2.3HGF及C-Met蛋白在胆管癌组织表达与临床病理特征的关系HGF蛋白的表达与淋巴结转移、分化程度及TNM分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)；与性别、年龄、肿瘤大小等其他因素无关，差异无统计学意义(P>0.05)。C-Met蛋白的表达与TNM分期、淋巴结转移有关，差异有统计学意义(P<0.05)；而与性别、年龄、肿瘤大小及分化程度等其他因素无关，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

A：C-Met在正常胆管组织中的表达；B：C-Met在胆管癌组织中的表达。

图2　C-Met蛋白的表达情况(Envision，×100)

3讨论

胆管癌已成为临床较为常见的恶性肿瘤，早期发病无明显临床症状，国内流行病学资料证实胆管癌的发生率和病死率逐渐增加，导致这种现象的主要原因是缺乏有效的诊断和治疗手段。胆管癌并无特异性的肿瘤标志物，仅CA19-9、CA125、癌胚抗原(CEA) 有一定价值，但是这些肿瘤标志物没有较高的特异度与灵敏度[5]。随着肿瘤分子生物学研究的逐渐深入,学者们发现表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、HGF、IL-6等能促进胆管细胞DNA合成[6-8]。HGF是一种多功能细胞因子,尽管其结构、基因序列等已明确,但其在胆管癌中发挥作用的具体机制尚不完全清楚。基础研究表明，HGF具有促有丝分裂活性,可以促进胆管癌的转移，但临床上关于HGF对胆管癌的影响的报道却很少见[9]。C-Met是从NIH3T3 细胞中克隆出来的一种原癌基因，属于酪氨酸激酶家族的成员，也是HGF惟一的受体。目前已经证实C-Met 参与了多种恶性肿瘤的发生，并且有文献报道C-Met也参与胆管癌的发生过程[10-12]。因此，本研究期望通过检测血清中HGF蛋白与C-Met蛋白的水平及在胆管癌组织中的表达，探讨其具有的临床意义。

本研究发现，胆管癌患者血清中HGF的水平较健康人明显升高，这与国外学者Balaban等[13]的研究较为相似。据此，笔者检测了HGF在胆管癌组织中的表达，发现HGF蛋白的表达与淋巴结转移、分化程度及TNM分期相关，与性别、年龄、肿瘤大小等其他因素无关；C-Met蛋白的表达与TNM分期、淋巴结转移相关，而与性别、年龄、肿瘤大小及分化程度无关。

有研究表明，HGF/C-Met不仅可以调节肿瘤细胞间的黏附作用、促进细胞外基质的降解，还可以促进肿瘤血管生成。有文献表明，HGF/C-Met可能影响胆管癌的预后[14]。

为了研究HGF/C-Met与胆管癌预后的关系，笔者检测了胆管癌患者术后第3、7、10天血清中HGF及C-Met的水平，我们发现，术后第3天血清中HGF及C-Met的水平较术前并未明显下降，但在第7、10天胆管癌患者血清中HGF及C-Met的水平明显下降，甚至达到正常水平。因此，笔者认为血清中HGF及C-Met的水平对预测胆管癌的复发及转移具有一定的参考价值。

综上所述，本研究结果表明HGF及C-Met在胆管癌患者血清和组织中呈高度活化，其活化对维持胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力起重要作用。本研究认为深入认识 HGF及C-Met 在胆管癌进展中的作用可以为开发胆管癌的分子靶向治疗提供实验依据。

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Expression and clinical significance of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma

Wang Jin1,Zhao Yijie2,Cui Guangbin2,Shang Peizhong1△

(1.DepartmentofGeneralSurgery,the251thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Zhangjiakou,Hebei075000,China;2.NorthernCollegeofHebei,Zhangjiakou,Hebei075061,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma.MethodsThe levels of HGF and C-Met were measured by ELISA,the expression of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma and health control was detected by immunohistochemistry.ResultsThe preoperative levels of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma were higher than the health control(P<0.05).Compared with the preoperative state,the levels of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma on the 3rd day after operation did not change significantly.However,the levels of HGF and C-Met on the postoperative 7th and 10th day decreased obviously.In addition,the expression of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma was 76.2%,81.0%,respectively,which is higher than that in normal tissue(P<0.01).ConclusionThere is an abnormal expression of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma,which may be related to the incidence and development of cholangiocarcinoma.

[Key words]cholangiocarcinoma;hepatocyte growth factor;C-Met;clinical and pathological features

作者简介：王金(1986-)，主治医师，本科，主要从事肝胆外科方向研究。△通讯作者，Tel:18903138087；E-mail:spz251@163.com。

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.019

[中图分类号]R735.8

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)17-2362-03

(收稿日期：2015-11-22修回日期：2016-01-10)