张健民,陈　鹏,张凡喜,黄晓龙,周玉峰

(中国人民解放军第三二四医院神经外科,重庆 400020)



血管紧张素1-7对蛛网膜下腔出血后血脑屏障通透性的保护作用*

张健民,陈鹏,张凡喜△,黄晓龙,周玉峰

(中国人民解放军第三二四医院神经外科,重庆 400020)

[摘要]目的分析血管紧张素Ang-(1-7)对蛛网膜下腔出血(SAH)后血脑屏障通透性的作用及机制。方法枕大池二次注血法制备SAH大鼠，伊文思蓝(Evans blue)检测Ang-(1-7)处理后SAH大鼠血脑屏障通透性及脑组织含水量；实时荧光定量PCR(RT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western blot)分析脑组织黏连蛋白ICAM-1、VCAM-1的表达。人工血性脑脊液(BCSF)刺激血管内皮细胞(HBMEC)，检测细胞通透性及细胞增殖与凋亡情况。结果Ang-(1-7)可降低SAH大鼠脑组织中Evans blue渗透量及脑组织含水量，具有剂量和时间依赖性，以10-5mol/L Ang-(1-7)处理24 h时变化最为显著，SAH大鼠脑组织中ICAM-1、VCAM-1表达水平显著上调。同时Ang-(1-7)作用的BCSF刺激的血管内皮细胞中Evans blue的渗透量明显减少，ICAM-1、VCAM-1的表达水平及细胞增殖活力显著增加，细胞凋亡减少。结论Ang-(1-7)具有保护蛛网膜下腔出血后血脑屏障通透性作用。

[关键词]蛛网膜下腔出血;血脑屏障通透性;Ang-(1-7);血管内皮细胞

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是由动脉硬化等多种病因引起的脑部血管病变过程，具有极高的致死、致残率[1]。其发病机制与血脑屏障通透性的改变有关，后者则受血管内皮细胞、黏连蛋白等多种因素综合调控[2-3]。血管紧张素1-7[Ang-(1-7)]是由AngⅠ或Ⅱ在血管紧张素转化酶作用下产生的活性物质，能改善脑部氧化应激及神经功能状况，降低脑梗死风险，对心血管及脑部组织病变具有保护作用[4]。本文以SAH小鼠模型为对象，分析了Ang-(1-7)对SAH后血脑屏障通透性及黏连蛋白ICAM-1、VCAM-1表达的影响，并以人工血性脑脊液体外模拟SAH过程，分析Ang-(1-7)对血管内皮细胞功能活性的影响，探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1材料雄性SD级大鼠60只(平均体质量280～320 g，重庆医科大学实验动物中心)；实时荧光定量PCR(RT-PCR)仪(Bio-Rad公司)；流式细胞仪(Becton-Dickinson公司)；Ang-(1-7) (Sigma公司)；伊文思蓝(Evans,blue,Sigma公司)；人脑微血管内皮细胞(上海复蒙基因生物科技有限公司)；DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)；ICAM-1、VCAM-1、β-actin抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；羊抗兔二抗(北京鼎国公司)；总RNA提取试剂盒(Tiangen公司)；RT-PCR MasterMix kit(Toyobo公司)；ICAM-1、VCAM-1、GAPDH引物(Takara公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)细胞增殖-毒性检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1SAH动物模型制备及分组SD大鼠分为假手术组(6只)、模型对照组(6只)、实验组(48只)。参照Müller等[3]方法用枕大池二次注血法制备SAH大鼠。SD大鼠用3%戊巴比妥钠麻醉，注射器针头经环枕筋膜刺入枕大池中，抽出0.4 mL/kg脑脊液，将0.8 mL/kg耳中央动脉血缓慢注入枕大池蛛网膜下腔中。手术48 h后，同样方法二次注入0.4 mL/kg动脉血。假手术组注入等量生理盐水。模型制备24 h后，用微型真空泵在大鼠侧脑室植入导管，缓慢注入含不同浓度Ang-(1-7)(10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L)脑脊液，每种浓度设6个重复，24 h后进行Evans blue及脑水肿检测。同时对10-5mol/L Ang-(1-7)处理6、12、24、48 h后的SAH大鼠进行检测。设未经Ang-(1-7)处理的SAH大鼠为对照组。

1.2.2细胞培养与处理参照陈志等[5]方法，按正常人血液与人工脑脊液1∶1比例混合配制血性脑脊液(BCSF)，离心后取上清液与DMEM培养基2∶1比例混合待用。HBMEC细胞分为对照组、BCSF刺激组和Ang-(1-7)处理组。各组处理24 h后用于相关检测。

1.2.3Evans blue检测大鼠静脉注射100 μL Evans blue染液(2%，4 mL/kg)，循环3 h，过量麻醉处死，自右心室注入50 mL生理盐水冲洗血管，取出脑组织标本，称质量，取一定量组织切块，按1∶9比例4 ℃过夜浸泡于50%三氯乙酸中。匀浆后4 000 r/min离心30 min，收集上清液于620 nm下测Evans blue吸光值，根据Evans blue标准溶液(0～6.25 μg/mL)绘制Evans blue吸光值标准曲线，得出脑组织中Evans blue水平。

1.2.4脑组织含水量检测大鼠过量麻醉处死，迅速取出其脑组织称质量，并于100 ℃烘箱焙干48 h后再称质量，脑组织含水百分比=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.2.5RT-PCR检测取大鼠脑组织于离心管中，提取总RNA逆转录出cDNA，进行RT-PCR检测，以GAPDH为内参，依据2-ΔΔCT法计算各组mRNA的相对表达量。

1.2.6Western blot检测SDS裂解法提取大鼠脑组织总蛋白，煮沸5 min后，取80 μg上清液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳，转PVDF膜。3%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜，TBST洗膜3次。加入二抗HRP-IgG(1∶2 000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL显色液曝光显影。

1.2.7细胞增殖检测细胞接种于96孔板中，分别于37 ℃恒温培养6、12、24、48 h，用MTT细胞增殖-毒性检测试剂盒法，490 nm波长下测细胞光密度(OD)值，判断细胞增殖情况。

1.2.8细胞凋亡检测收集并调整细胞密度为1×106cell/mL，加入终浓度为0.5 μg/mL 的Annexin V-FITC和0.6 μg/mL的PI，避光孵育15 min后，流式细胞仪分析。

2结果

2.1Ang-(1-7)减缓SAH大鼠血脑屏障通透性的改变随Ang-(1-7)水平增加，SAH大鼠脑组织Evans blue渗透量及含水量逐渐降低，至10-6mol/L时出现显著变化，10-5mol/L时达到最低(P<0.05)，且随浓度增加保持不变(图1A、B)。10-5mol/L Ang-(1-7)处理时，脑组织Evans blue渗透量随处理时间不同差异明显，以处理24 h的变化最为显著(P<0.05)，随作用时间增加保持不变(图1C)。

A：不同浓度Ang-(1-7)处理后SAH大鼠脑组织Evans blue渗透量；B：不同浓度Ang-(1-7)处理后SAH大鼠脑组织含水量;C：10-5mol/L Ang-(1-7)处理不同时间后SAH大鼠脑组织Evans blue渗透量。

图1Ang-(1-7)对SAH大鼠脑组织中Evans blue和脑组织含水量的影响

2.2Ang-(1-7)对SAH大鼠脑组织中ICAM-1、VCAM-1表达的影响10-5mol/L Ang-(1-7)处理24 h后，SAH大鼠脑组织中黏连蛋白ICAM-1、VCAM-1的mRNA和蛋白表达水平均显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

A、B：ICAM-1和VCAM-1的mRNA及蛋白水平。

图2Ang-(1-7)对SAH大鼠脑组织中ICAM-1和

VCAM-1表达的影响

A：HBMEC中Evans blue水平；B、C:HBMEC中ICAM-1和VCAM-1的mRNA及蛋白水平。

图3Ang-(1-7)对血管内皮细胞中Evans blue及

ICAM-1、VCAM-1表达的影响

2.3Ang-(1-7)对血管内皮细胞通透性及ICAM-1、VCAM-1表达的影响BCSF刺激后，内皮细胞中Evans blue水平较对照组明显增高，ICAM-1、VCAM-1表达水平则显著降低。10-5mol/L Ang-(1-7)处理24 h后，细胞中Evans blue水平明显减少，而ICAM-1、VCAM-1的表达水平则显著增加(P<0.05)，见图3。

2.4Ang-(1-7)对血管内皮细胞增殖活力的影响10-5mol/L Ang-(1-7)处理24 h后，内皮细胞增殖活力显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

2.5Ang-(1-7)对血管内皮细胞凋亡的影响10-5mol/L Ang-(1-7)处理24 h后，内皮细胞凋亡水平显著下降(P<0.05)，见图5。

图4　Ang-(1-7)对血管内皮细胞增殖活力的影响

A、B：细胞凋亡水平及定量。

图5Ang-(1-7)对血管内皮细胞凋亡的影响

3讨论

血脑屏障结构发生变化时，血流中的蛋白等物质会渗透进入脑部组织中，引起脑水肿等继发性脑损伤的发生[6]。已有研究表明，SAH会诱发急性脑血管痉挛及脑组织缺血症状，引起胞内黏连蛋白ZO-1和Occludin表达水平的下调，Akt/FOXO信号通路的失活，进而导致血脑屏障通透性发生改变[7]。血脑屏障由血管内皮细胞及多种细胞和黏连蛋白构成，其结构完整性与内皮细胞的功能活性密切相关[8]。血管内皮细胞凋亡是SAH引发血脑屏障损伤的重要原因。本文通过构建大鼠SAH模型，证实了SAH会导致动物脑部血脑屏障受损及脑水肿的出现。体外实验表明，人工血性脑脊液能引起血管内皮细胞通透性增加、增殖活力减弱、凋亡增强。

Ang-(1-7)是由AngⅠ或Ⅱ在血管紧张素转化酶ACE2作用下产生的活性物质，能与特异性受体Mas结合，形成ACE2-Ang-(1-7)-Mas反应通路，在体内内稳态的维持方面发挥重要作用[9]。Ang-(1-7)能改善脑部氧化应激及神经功能状况，降低脑梗死风险，对心血管及脑部组织病变具有保护作用。Lu等[10]发现，在急性脑缺血损伤小鼠模型中，ACE2-Ang-(1-7)-Mas反应通路被上调激活，证实了该通路对于急性脑损伤具有重要保护作用。Jiang等[11]进一步发现，在脑损伤小鼠模型中，Ang-(1-7)能特异性调节Mas/eNOS信号通路，促使脑血管内皮细胞发生增殖，进而促进脑血管再生，提高小鼠对脑缺血损伤的耐受能力。Wu等[12]也发现，外源性Ang-(1-7)可以调节内皮细胞中TIMP-1/MMP-9表达水平，进而上调胞内黏连蛋白Claudin-5和ZO-1的表达，提升内皮细胞张力，对缺血再灌注引起的血脑屏障损伤发挥保护性作用。本实验证实，外源性Ang-(1-7)可以剂量和时间依赖性方式降低SAH大鼠脑组织中Evans blue水平及脑组织含水量，上调黏连蛋白ICAM-1、VCAM-1的表达水平，调控血管内皮细胞增殖凋亡活力，对SAH引起的血脑屏障损伤和脑水肿具有改善作用。

综上所述，本文以SAH小鼠模型为对象，证实了外源性Ang-(1-7)对于SAH引起的血脑屏障损伤和脑水肿具有改善作用，这一过程可能与Ang-(1-7)对血管内皮细胞功能活性的调控有关。该发现为治疗因SAH所引发的脑部病变提供了参考。

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Protective effect of Ang-(1-7) on the permeability of blood brain barrier after subarachnoid hemorrhage*

Zhang Jianmin,Chen Peng,Zhang Fanxi△,Huang Xiaolong,Zhou Yufeng

(DepartmentofNeurosurgery,theNO.324HospitalofPeople′sLiberationArmy,Chongqing400020,China)

[Abstract]ObjectiveTo analysis the effects of Ang-(1-7) on the blood brain barrier permeability after subarachnoid hemorrhage.MethodsSAH-rats were produced by two times injection of blood into cisterna magna.Evans blue was used to detect the the permeability of SAH-rats brains and brain water content.RT-PCR and Western blot were performed to measure the expression of adhesion protein ICAM-1 and VCAM-1 in brains of SAH-rats.The artificial hemorrhagic cerebrospinal fluid (BCSF) was used to stimulate vascular endothelial cells (HBMEC),and the proliferation and apoptosis of HBMEC cell were analyzed.ResultsAng-(1-7) reduced the content of Evans blue and brain water in brains of SAH-rats in dose and time dependent manner with the most significant change under the treatment of 10-5mol/L Ang-(1-7) for 24 h (P<0.05).Under the above condition,the mRNA and protein levels of ICAM-1 and VCAM-1 in brains of SAH-rats were significantly up-regulated (P<0.05),while the content of Evans blue in HBMEC cells stimulated by BCSF was obviously reduced.Besides,Ang-(1-7) was observed to increase the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in BCSF-stimulated HBMEC cells,enhance the proliferation of HBMEC cells but reduce their apoptosis.ConclusionAng-(1-7) plays a protective role in the blood-brain barrier damage induced by subarachnoid hemorrhage.

[Key words]subarachnoid hemorrhage;blood-brain barrier permeability;Ang-(1-7);vascular endothelial cell

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.007

*基金项目：国家科技惠民计划项目(2013GS500101-15)；中国人民解放军神经创伤防治重点实验室2013开放课题资助项目(NTP2013005)。

作者简介：张健民(1976-)，主治医师，本科，主要从事脑外科工作。△通讯作者，Tel:(023)68762064;E-mail:youhua_huang@163.com。

[中图分类号]R363.1

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)17-2327-03

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-03-06)