李　喆，卢一郡，吕立文，卢国浩，李　卫，俞　宁，卢俊宇

(广西壮族自治区人民医院急诊科，南宁 530021)



丙泊酚预处理对大鼠肢体缺血再灌注损伤的影响

李喆，卢一郡，吕立文，卢国浩，李卫，俞宁，卢俊宇

(广西壮族自治区人民医院急诊科，南宁 530021)

[摘要]目的观察丙泊酚对大鼠肢体缺血再灌注损伤的影响。方法选择健康成年雄性SD大鼠60只，分为假手术组、缺血再灌注组、丙泊酚药物组，每组20只，各组又根据再灌注时间分成4个亚组。复制大鼠经典右下肢缺血再灌注模型，恢复血流灌注前5 min用丙泊酚注射液(50 mg/kg，腹腔注射)处理，分别于再灌注后3、6、9、12 h进行取材，检测血清样本中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子κB(NF-κB)水平、肌肉组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平，以及计算肌肉湿干质量比值。结果恢复灌注后各时间段内，相对于缺血再灌注组，丙泊酚处理后能降低TNF-α、NF-κB的表达水平(P<0.05)，抑制组织MDA水平增加(P<0.05)，抑制SOD水平的减少(P<0.05)，也明显减轻肌肉组织的水肿(P<0.05)。结论丙泊酚预处理可通过遏制炎症因子表达、减轻氧自由基损害从而对缺血再灌注肢体具有保护作用。

[关键词]丙泊酚；肢体；缺血再灌注损伤；炎症因子；氧自由基

肢体缺血这一病理现象常见于肢体大血管损伤、血栓再通、断肢再植、止血带使用时间过长等，恢复缺血肢体血流再灌注后，肢体的细胞功能代谢障碍及结构破坏并未减轻反而加重，这种血液再灌注使缺血性损伤进一步加重的现象称为缺血/再灌注损伤[1](ischemia-reperfusion injury，IRI)，其发生、发展主要与炎性细胞因子介导的损伤机制相关[2]。丙泊酚是临床常用的静脉麻醉药，近年来研究表明其对有一定的保护作用[3-4]。本研究采用大鼠肢体缺血-再灌注(IR)模型，观察丙泊酚对缺血肢体的保护作用，并从炎性因子、氧自由基等方面探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1材料选择健康成年雄性SD大鼠60只，体质量180～230 g。分为3组：假手术组(C组，20只)、缺血再灌注组(IR组，20只)、丙泊酚干预组(P组，20只)，每组20只，各组根据恢复组织再灌注时间不同分为3、6、9、12 h共4个亚组，每亚组5只。

1.2主要试剂与仪器大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(96T)、大鼠核因子κB(NF-κB)ELISA试剂盒(96T)均购自美国R&D公司，进口分装。丙二醛(MDA)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒由南京建成生物工程研究所提供。丙泊酚由AstraZeneca公司提供。

1.3方法

1.3.1动物模型制备各组大鼠术前12 h禁食，自由饮水。予3%戊巴比妥钠(首剂40 mg/kg，维持量20 mg/kg)腹腔注射，麻醉成功后行仰卧位固定。IR组：常规备皮后，于右腹股沟处沿血管走向纵行切开皮肤、皮下组织，并钝性分离缝匠肌后部，游离股动静脉和股神经。用微血管夹分别将股动静脉夹闭，阻断血流，并用张力带于股鞘下环扎肢体，以阻断侧支循环。肢体缺血2 h后，在除去微血管夹及张力带即恢复血流灌注前5 min，腹腔注射生理盐水1 mL，随即除去微血管夹及张力带，恢复血流灌注。C组：游离出股动静脉后，不上微血管夹和张力带，即不阻断血流，余操作同IR组。P组：肢体缺血2 h后，在除去微血管夹及张力带即恢复血流灌注前5 min，腹腔注射丙泊酚注射液(50 mg/kg)，余操作同IR组。

1.3.2动物处理及采集标本各组大鼠经上述不同处理后，按所在亚组要求，分别在恢复血流再灌注3、6、9、12 h后再次行腹腔麻醉并固定，迅速开腹分离出下腔静脉后抽取血样3 mL，注入抗凝管内封存。所取血液静置1 h后以3 000 r/min离心10 min，提取血清标本，注入EP管后-70 ℃保存。游离右下肢腓肠肌上下两端，组织剪断离后，分成2段，其中1段置入甲醛溶液固定，备用于肌肉组织匀浆液的制备，另1段直接称取湿质量，并记录数值。

1.3.3血浆标本检测采用双抗体夹心ELISA测定，在酶标仪450 nm波长处测各孔吸光度(A)值，通过标准曲线计算各血清样本中TNF-α、NF-κB的水平。具体步骤严格按照试剂盒(美国R&D公司)说明书进行操作。

1.3.4肌肉标本检测称取100 mg肌肉组织，加入0.9 mL生理盐水制成10%的组织匀浆，分别采用硫代巴比妥酸(TPA)法及黄嘌呤氧化酶法，检测肌肉组织中MDA的水平，以及SOD的活性。严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书操作。

1.3.5组织湿/干质量比各组大鼠右下肢肌肉取材并称取湿质量后，分别记录好数值。然后置于55 ℃恒温箱中烤干至恒重，即为干质量，分别记录好干质量数值。计算出湿质量与干质量的比值，以此反映肌肉组织的水肿程度。

2结果

2.1各组血清TNF-α、NF-κB的表达TNF-α组间比较：与C组相比，IR组水平在再灌注后6、9、12 h这3个时点均显著升高(P<0.05)；P组水平在再灌注后6、12 h这两个时点有升高(P<0.05)。与IR组相比，P组水平在4个时点的表达均显著降低(P<0.05)。TNF-α组内比较：C组各时点水平间无明显差异；IR组水平自再灌注后3 h开始升高，至9 h达高峰，12 h后有下降；P组水平则是再灌注后6 h及12 h偏高，变化无明显规律，见表1。

NF-κB组间比较：与C组相比，IR组水平在再灌注后4个时点均显著升高(P<0.05)。与IR组相比，P组水平在再灌注后9、12 h均显著降低(P<0.05)。NF-κB组内比较：C组水平再灌注后4个时点均无明显差异；IR组水平自再灌注后3 h开始升高，至12 h达高峰；P组水平再灌注后4个时点差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1各组大鼠血清中TNF-α水平变化

组别3h6h9h12hC组119.14±16.93123.07±17.70b121.48±15.99b127.13±17.46bIR组124.31±22.13213.21±49.49ac215.85±59.67ac192.00±34.69acP组115.15±29.71b156.92±17.31ab114.75±39.26b146.03±17.41ab

a：P<0．05,与C组比较;b：P<0．05,与IR组比较;c：P<0．05,与IR 3 h组比较。

表2各组大鼠血清中NF-κB水平变化

组别3h6h9h12hC组195.62±24.01207.23±17.68204.22±25.24213.10±31.54IR组319.53±37.98a365.56±54.43ac398.30±50.58ac544.41±62.51acdP组369.00±33.80348.43±45.63221.04±37.73b339.15±39.23b

a：P<0．05,与C组比较;b：P<0．05,与IR组比较;c：P<0．05,与IR 3 h组比较;d：P<0．05,与IR 9 h组比较。

2.2各组肌肉组织MDA、SOD表达变化各时间点IR组中MDA的水平均明显高于C组及P组，差异有统计学意义(P<0.05)，而IR组SOD活性则显著低于C组与P组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组内不同时点MDA与SOD变化水平均无明显规律，见表3、4。

表3　各组大鼠腓肠肌MDA水平变化

a：P<0．05,与IR组比较。

表4　各组大鼠腓肠肌SOD活性变化

a：P<0．05,与IR组比较。

2.3各组大鼠右下肢肌肉组织湿质量/干质量同时点间比较，IR组各时段湿质量/干质量均显著高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；P组则显著低于IR组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组组内不同时点比较，湿质量/干质量随时间变化有一定上升趋势，见表5。

表5　各组大鼠腓肠肌湿质量/干质量比值

a：P<0．05,与C组比较；b：P<0.05,与IR组比较。

3讨论

肢体缺血在临床中十分常见，肢体IRI这一病理生理过程的发生、发展机制，目前认为主要有炎症因子反应学说及氧自由基损伤学说两种[5-6]。肢体IRI能够引起NF-κB的活化，使NF-κB的表达量显著增加[7]，NF-κB的激活可增强TNF-α基因转录，使其水平升高。TNF-α是机体重要的炎性因子[8]，广泛参与应激、感染及IRI等过程和调控，其水平异常升高可直接作用于细胞，使组织细胞溶解[9]，还可引起血管内皮细胞形态和细胞骨架结构的变化，使其功能受损，破坏凝血机制，形成血栓，从而进一步加重远端骨骼肌的水肿。IRI时可通过线粒体、白细胞及花生四烯酸等产生大量氧自由基[10]，氧自由基能够直接损伤细胞膜结构，而产生脂质过氧化链式反应来破坏细胞[11]。MDA[12]是自由基连锁反应-脂质过氧化反应的终产物，可间接反映机体组织受氧自由基攻击的严重程度；SOD是生命体的活性物质，能够还原过氧化物，减少活性氧簇的产生，保护细胞不受氧自由基损伤，反映了机体清除氧自由基的能力[13]。

本研究通过复制大鼠肢体IRI模型，通过观察上述4个指标在再灌注后多个时点的变化，结果证明，IR组各时段NF-κB的水平均高于C组，提示肢体在恢复血流灌注3 h内，NF-κB已被激活，其升高促进TNF-α的表达，后者在再灌注6 h左右开始升高，并持续至恢复血流灌注12 h；而氧自由基爆发引起脂质过氧化反应，使得组织MDA水平在再灌注6 h左右开始升高，到12 h也未下降。另一方面，骨骼肌的湿质量/干质量也客观反映了肌肉的水肿程度，IR组各时段肌肉湿质量/干质量均高于C组。丙泊酚作为临床常用麻醉药物，众多实验证明其对肢体及多脏器的IRI具有保护作用。本实验中，P组大鼠血清NF-κB、TNF-α的表达，与IR组比较，在再灌注各时段均有不同程度的下降，提示药物对炎性因子的释放存在抑制作用；其次，与IR组相比，P组中MDA的水平较低，而SOD的表达则较IR组升高，提示丙泊酚能够降低IRI后肌肉组织MDA水平，并增强SOD活性，表明丙泊酚可有效抑制IRI损伤所导致的氧自由基爆发效应，清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应；此外，对比肌肉组织湿质量/干质量，说明丙泊酚组骨骼肌组织较IRI组水肿程度有所减轻。

综上所述，丙泊酚对IRI损伤的肢体具有保护作用，与其能遏制炎症因子表达、减轻氧自由基损害有关。但是，IRI损伤是一个多因素、多机制、多途径综合作用的结果，临床治疗应更具针对性。本研究证实了丙泊酚对肢体IRI损伤防治的有效性，有关药物的剂量及用药的时间还需细化与更进一步探讨。

参考文献

[1]Mccord JM．Oxygen derived free radicals in postischemic tissue injury[J]．N E J Mel，1985，312(3)：159．

[2]Esposito E,Cuzzocrea S.TNF-alpha as a therapeutic target in inflammatory diseases,ischemia-reperfusion injury and trauma[J]．Curr Med Chem，2009，16(24)：3152-3167.

[3]Wang Z，Kou D，Li Z，et al．Effects of propofol-dexmedetomidine combination on ischemia reperfusion-induced cerebral injury[J]．Neuro Rehabilitation，2014，35(4)：825-834.

[4]郑海燕．丙泊酚麻醉对围手术期肝缺血再灌注损伤患者血浆一氧化氮/内皮素-1和炎症细胞因子的影响[J]．实用医学杂志，2009，25(23)：3995-3997.

[5]Wanderer AA．Proposed pathobiologic mechanisms of hypoxia-ischemia-reperfusion in corticosteroid-resistant neutrophilic asthma and consideration of interleukin 1 targeted therapy[J]．Ann Allergy Asthma Immunol，2011，106(1)：69-72.

[6]Schmidt CA，Rancic Z，Lachat ML，et al．Hypothermic，initially oxygen-free，controlled limb reperfusion for acute limb ischemia[J]．Ann Vasc Surg，2015，29(3)：560-572.

[7]Higuchi Y，Kawakami S，Hashida M.Development of cell-selective targeting systems of NF kappaB decoy for inflammation therapy[J].Yakugaku Zasshi，2008，128(2)：209-218.

[8]Dabhi B，Mistry KN.In silico analysis of single nucleotide polymorphism (SNP) in human TNF-α gene[J]．Meta Gene，2014(2)：586-595.

[9]Niu X，Huang WH，De Boer B，et al．Iron-induced oxidative rat liver injury after non-heart-beating warm ischemia is mediated by tumor necrosis factor α and prevented by deferoxamine[J].Liver Transpl，2014，20(8)：904-911.

[10]Ozsoy M，Gonul Y，Bal A，et al．Effect of IL-18 binding protein on hepatic ischemia-reperfusion injury induced by infrarenal aortic occlusion[J].Ann Surg Treat Res，2015，88(2)：92-99．

[11]Faghihi M，Alizadeh AM，Khori V，et al.The role of nitric oxide,reactive oxygen species,and protein kinase C in oxytocin-induced cardioprotection in ischemic rat heart[J].Peptides，2012，37(2)：314-319.

[12]张良，代维，高志明，等．血必净注射液和丹参注射液治疗兔肢体缺血再灌注损伤的比较研究[J]．重庆医学，2013，42(31)：3724-3731.

[13]Bajpai A，Verma AK，Srivastava M，et al.Oxidative stress and major depression[J].J Clin Diagn Res，2014，8(12)：4-7.

Protective effect of propofol preconditioning on limb ischemia reperfusion injury in rats

Li Zhe,Lu Yijun,Lyu Liwen,Lu Guohao,Li Wei,Yu Ning,Lu Junyu

(DepartmentofEmergency,thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomusRegion,Nanning,GuangxiZhuangAutonomusRegion530021,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of propofol on rat′s limb ischemia reperfusion injury.MethodsSixty healthy SD rats were randomly divided into sham operate group,ischemia-reperfusion group and propofol group (n=20),each group was divided into 4 subgroups according to the different reperfusion time.To copy the right lower limb ischemia reperfusion model,5 min before reperfusion,use propofol injection (50 mg/kg,intraperitoneal inject),various subjects in the corresponding time points (3,6,9,12 h) were sacrificed.TNF-α,NF-κB of blood and MDA,SOD of Skeletal muscle were measured,calculate muscle wet dry weight ratio.ResultsCompared with ischemia reperfusion group,propofol could significantly reduce expression of TNF-alpha,NF-κB levels in serum (P<0.05),inhibit the increase of the MDA level and decrease of the SOD level in muscle (P<0.05),also reduce the extent of skeletal muscle cell edema(P<0.05).ConclusionPropofol can attenuate limb ischemia reperfusion injury by inhibiting inflammation response and reducing the oxygen free radicals′ damage.

[Key words]propofol;limb;ischemia-reperfusion injury;inflammatory factor;oxygen free radicals

作者简介：李喆(1984-)，住院医师，硕士，主要从事急危重症医学研究。

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.010

[中图分类号]R459.7

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)17-2337-03

(收稿日期：2015-12-23修回日期：2016-02-26)