李　娜，但汉龙，刘　云，罗旭璐，贺　鹏，阚　欢,赵　平

(西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室,云南 昆明 650224)

雀嘴茶中咖啡酰熊果苷提取工艺的响应面法优化

李娜，但汉龙，刘云，罗旭璐，贺鹏，阚欢,赵平

(西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室,云南 昆明 650224)

[摘要]【目的】 确定雀嘴茶中6′-O-咖啡酰熊果苷(CA)超声辅助提取的最佳工艺。【方法】 采用超声辅助法提取雀嘴茶中的CA，通过单因素试验考察甲醇体积分数(50%，60%，70%，80%，90%)、液(mL)料(g)比(8∶1，10∶1，12∶1，14∶1，16∶1)、超声时间(10，15，20，25，30 min)、提取次数(1，2，3，4，5次)对CA提取率的影响，并利用响应面法优化CA的超声辅助提取工艺。【结果】 超声辅助法提取CA的理论最佳工艺条件为：甲醇体积分数72.87%、液料比 15.87∶1、超声时间18.96 min、提取次数3.63次，CA提取率的理论预测值可达到23.12%。根据实际操作的需要，将提取工艺条件修正为甲醇体积分数73%、液料比16∶1、超声时间19 min、提取次数4次，在此条件下CA实际提取率为23.03%，与理论值较为接近。【结论】 采用响应面法优化雀嘴茶中CA超声辅助提取的最佳工艺完全可行。

[关键词]雀嘴茶；6′-O-咖啡酰熊果苷；超声辅助提取；响应面法

雀嘴茶由杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)植物樟叶越桔(V.dunalianum)的顶芽或嫩叶经一系列传统工艺加工而成，因呈锥状形似雀嘴而得名[1-2]，为云南省滇中地区特有的绿色茶品。雀嘴茶中氨基酸种类齐全，含有丰富的矿质元素和营养素[3]，其汤色橙黄明亮，香气馥郁，醇厚回甘，具有祛风除湿、舒筋活络等功效，自古作为彝族民间保健茶在滇中地区广泛饮用至今。尹继庭等[4-5]对雀嘴茶原料樟叶越桔新鲜叶芽进行了香气成分的GC-MS分析和内转录间隔区序列分析。Zhao等[6]首次发现雀嘴茶是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特殊植物资源，并从中分离鉴定了29个化合物，其中6′-O-咖啡酰熊果苷(6′-O-caffeoylarbutin,CA)的得率高达22%，这为大量生产天然活性熊果苷类衍生物提供了可能。Xu等[7]发现，CA对黑色素的抑制活性和安全性均优于熊果苷，其活性为熊果苷的2倍，细胞毒性仅为熊果苷的1/2。而熊果苷是国际公认的21世纪理想的皮肤美白祛斑活性剂[8-10]，但通常以微量形式存在于越桔等属植物中，且天然植物来源困难。因此，可将雀嘴茶作为熊果苷天然替代品资源加以利用，而开展其中CA的高效提取工艺研究显得十分必要。

超声辅助提取法作为一种高效节能的新兴技术，近年来被广泛应用于植物化学等相关领域[11-14]。在提取工艺条件优化上，与传统的正交试验法相比，响应面分析法(Response surface methodology,RSM)目前已成为一种通用而有效的设计分析方法，常用于确定各因素及其交互作用在提取过程中对目标响应值的影响，以达到优化工艺的目的[15-19]。本研究拟采用超声辅助法提取雀嘴茶中的CA，在单因素试验基础上选取甲醇体积分数、液料比、超声时间和提取次数4个因素进行中心组合设计，利用响应面法优化CA的超声辅助提取工艺，以期为CA的大量生产及其高附加值产品的研发等提供参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

雀嘴茶干燥成品于2014-04购于云南省武定县，经粉碎过0.63 mm(40目)筛后备用。CA对照品为西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室从雀嘴茶中分离所得，经HPLC分析其纯度达98%，并通过MS、1H和13C NMR波谱解析鉴定其结构为6′-O-咖啡酰熊果苷[6]。甲醇、乙醇、醋酸均为分析纯，水为重蒸馏水。

1.2仪器与设备

Agilent 1200 series高效液相色谱仪，美国Agilent技术公司；LU10AT型超声波清洗器，西班牙FUNGILAB公司；200 g装高速中药粉碎机，浙江瑞安市永历制药机械有限公司；CP224C电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1CA的提取工艺流程雀嘴茶→粉碎→加入提取液→超声辅助提取→过滤→稀释、定容→测定含量→计算提取率。

1.3.2CA提取率的测定(1)高效液相色谱条件。色谱柱：Thermo BDS HYPERSIL C18 (150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相A：水(含1% HAc)；流动相B：甲醇；洗脱条件：0～5.0 min(5% B)，5.0～5.1 min(5%～15% B)，5.1～25.0 min(15%～65% B)，25.0～25.1 min(65%～95% B)，25.1～35.0 min(95%～5% B)；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：5 μL。

(2)标准曲线的绘制。精密配制质量浓度为 1.0 mg/mL的CA对照品溶液，利用高效液相色谱仪分别取1，2，4，8，16和35 μL进样进行峰面积测定，以峰面积为纵坐标、进样量为横坐标进行线性回归，得到进样量(x)对峰面积(y)的回归方程为：y=457.18x-77.597 (R2=0.999 7)。

(3)CA含量测定及其提取率计算。取不同条件下超声提取后稀释定容的样品溶液各5 μL，按照标准曲线测定的方法进行操作，将测定所得的CA峰面积带入上述回归方程，结合稀释倍数求得样品溶液中的CA质量(g)，按下式计算样品在不同提取条件下的CA提取率：

CA提取率=[CA质量(g)/雀嘴茶质量(g)]× 100%。

1.3.3提取溶剂的筛选精密称取雀嘴茶粉末 1.000 g，按液(mL)料(g)比14∶1分别加入水或体积分数20%，40%，60%，80%，100%的甲醇(乙醇)，超声提取3次，每次 30 min，过滤、定容于100 mL容量瓶中，按1.3.2所示方法测定CA含量并计算其提取率，以确定最适提取溶剂。

1.3.4单因素试验精密称取雀嘴茶粉末1.000 g，以甲醇为溶剂，利用超声辅助提取法，在超声波功率120 W、甲醇体积分数80%、液料比14∶1、超声时间30 min、提取次数2次的条件下，固定其中4个因素，分别考察不同甲醇体积分数(50%，60%，70%，80%，90%)、液料比(8∶1，10∶1，12∶1，14∶1，16∶1)、超声时间(10，15，20，25，30 min)、提取次数(1，2，3，4，5)对CA提取率的影响，每组试验重复3次，以确定各因素的适宜范围。

1.3.5响应面法试验在单因素结果基础上，利用Design-Expert V8.0.6软件，根据中心组合试验设计原理，以CA提取率为响应值，以甲醇体积分数(A)、液料比(B)、超声时间(C)和提取次数(D)4因素为自变量，每个因素取3个水平以-1，0，1编码，进行四因素三水平中心组合试验设计，试验方案如表1所示。共设30个试验点，各个试验点以随机顺序进行，重复3次，取其平均值作为最终结果，并使用Design-Expert V8.0.6软件进行数据分析，建立数学模型，从而得到最佳的提取工艺条件。

表 1　雀嘴茶中CA提取的中心组合试验因素水平表

1.3.6验证试验根据试验操作的实际需要，对1.3.5响应面分析试验所得的最佳理论提取工艺条件进行适当修正后，准确称取雀嘴茶粉末1.000 g进行验证试验，试验重复3次，将所得实际提取率与回归方程所得的理论预测值进行比较，以验证响应面法所得试验参数的准确可靠性。

2结果与分析

2.1雀嘴茶中CA提取溶剂的选择

不同体积分数的甲醇和乙醇对CA提取率的影响见图1。

图 1　不同提取溶剂对雀嘴茶CA提取率的影响

由图1可知，除甲醇体积分数低于45%时其提取效果低于乙醇外，高体积分数甲醇的提取效果整体明显优于乙醇。以水为溶剂，超声辅助提取CA的得率仅为11.9%，提取效果远低于甲醇和乙醇。为此，本试验选择甲醇作为提取溶剂。

2.2雀嘴茶中CA提取工艺的单因素试验分析

由图2-a可知，当甲醇体积分数在50%～80%时，雀嘴茶中CA的提取率随甲醇体积分数的提高而显著增大；当体积分数为80%时，CA提取率达到最高；当体积分数大于80%后，CA提取率趋于下降，这可能是由于较多溶出的脂溶性杂质、色素等成分与CA竞争甲醇-水分子，进而导致CA提取率下降[20]。因此，甲醇体积分数确定为80%。

由图2-b可知，液料比为10∶1～14∶1时，雀嘴茶中CA的提取率随液料比的增加而上升；当液料比为14∶1时，CA提取率达到最高；当液料比大于14∶1后，CA提取率呈下降趋势，这可能是因为溶剂量过大导致CA浓度下降而不利于协同浸提所致[21]。因此，液料比确定为14∶1。

由图2-c可知，超声时间在10～15 min时，雀嘴茶中的CA提取率随超声时间的延长而上升；当超声时间为15 min时，CA提取率达到最高；当超声时间超过15 min后，CA提取率呈逐渐下降趋势，这可能是由于超声时间的延长增加了超声波的作用强度，使较多溶出的其他成分与CA竞争甲醇-水分子[20]而导致其提取率有所下降。因此，超声时间确定为15 min。

由图2-d可知，提取次数在1～3次时，雀嘴茶中的CA提取率随提取次数的增加而显著提高；提取次数超过3次后，CA提取率的增长趋势则趋于平缓。考虑到节约能源及成本等因素，确定提取次数为3次。

图 2甲醇体积分数(a)、液料比(b)、超声时间(c)和提取次数(d)对雀嘴茶CA提取率的影响

Fig.2Effects of methanol concentration (a),liquid-material ratio (b),ultrasonic time (c) and

extraction times (d) on extraction rate of CA fromV.dunalianum

2.3雀嘴茶中CA提取的响应面分析

雀嘴茶中CA提取的四因素三水平中心组合试验结果见表2。

表 2　雀嘴茶中CA提取的中心组合试验结果

续表 2　Continued table 2

2.3.1回归模型的建立及显著性检验对中心组合程序进行多元回归分析，回归模型的方差分析结果见表3。由表3求得的二次回归方程为：CA提取率=-40.250 42+0.706 96A+2.224 79B+0.514 75C+8.298 33D-6.25×10-3AB-3.05×10-3AC-0.014 125AD+4.125×10-3BC-0.072 500BD-0.022 5CD-3.420 83×10-3A2-0.049 896B2-7.283 33×10-3C2-0.783 33D2。其中A、B、C、D分别为甲醇体积分数、液料比、超声时间和提取次数的水平值。

表 3　雀嘴茶中CA提取的回归模型的方差分析

注：***.差异极显著P<0.001)；**. 差异高度显著(P<0.01)。

Note: ***.Extremely significant difference (P<0.001);**.Highly significant difference (P<0.01).

由表3可以看出，回归模型的显著性极高(P<0.000 1)，线性关系较好(R2=0.923 1)，表明所建立的二次回归模型成立，可用此模型来分析和预测超声辅助提取雀嘴茶中CA的提取率。从回归模型系数的显著性检验结果可知， 提取次数的一次项、二次项对雀嘴茶CA提取率影响极显著，液料比一次项、甲醇体积分数二次项对CA提取率的影响高度显著。各因素对CA提取率响应值的影响大小顺序为提取次数>液料比>超声时间>甲醇体积分数。

2.3.2响应面分析响应面图可以反映最佳参数及各参数之间的相互作用，每个响应面对其中2个因素进行分析，另外2个因素则固定在0水平上，若曲线越陡峭，则表明该因素对CA提取率的影响越大，相应表现为响应值变化的大小。

图3直观地反映了任何2个因素交互作用对雀嘴茶中CA提取率响应值的影响。由图3-a可知，CA提取率随液料比增加变化很大，而甲醇体积分数对CA提取率影响相对较小。由图3-b可知，CA提取率随超声时间和甲醇体积分数增大变化较小，二者交互作用不明显。由图3-c可以看出，提取次数对CA提取率影响较大，而甲醇体积分数对其影响很小，二者交互作用不明显。由图3-d可知，超声时间不变时，CA提取率随液料比增加而上升;而液料比不变时，CA提取率随超声时间增加总体变化不大。由图3-e可以看出，CA提取率随提取次数变化很大，而随液料比增大变化缓慢，二者交互作用不明显。由图3-f可知，提取时间不变时，CA提取率随提取次数的增加变化较大，而随超声时间的增加无明显变化。

图 3各因素交互作用对雀嘴茶CA提取率的响应面图和等高线图

Fig.3Response surfaces and corresponding contours for the interactive effects of

different factors on extraction rate of CA fromV.dunalianum

2.3.3最佳工艺条件的确定及验证通过Design-Expert V8.0.6软件对回归方程进行优化计算，得到超声辅助提取雀嘴茶中CA的最佳工艺条件为：甲醇体积分数72.87%，液料比15.87∶1,超声时间18.96 min，提取次数3.63次。在此条件下，CA提取率的理论预测值为23.12%。

为检验响应面优化提取工艺对雀嘴茶中CA提取效果的可靠性，同时考虑到实际操作的便利，将最优工艺条件修正为：甲醇体积分数73%，液料比 16∶1，超声时间19 min，提取次数4次。在此条件下超声辅助提取CA，通过3次平行验证试验得其实际平均提取率为23.03%，与理论预测值较为接近(相差0.09%)，说明运用响应面法优化得到的模型参数准确可靠。

3讨论与结论

本研究采用响应面法分析并优化了雀嘴茶中CA的超声辅助提取工艺，得到CA提取率4个影响因素的主次关系为：提取次数>液料比>超声时间>甲醇体积分数，其理论最佳提取工艺条件为：甲醇体积分数72.87%、液(mL)料(g)比15.87∶1、超声时间18.96 min、超声次数3.63次。在此条件下，CA提取率的理论预测值可达23.12%。根据实际操作的需要，将工艺条件修正为甲醇体积分数73%、液料比16∶1、超声时间19 min、超声次数4次。经验证，此条件下CA的实际提取率为 23.03%，与理论预测值较为接近，表明采用响应面法分析并优化的雀嘴茶CA超声辅助提取工艺完全可行，为雀嘴茶中CA的大量生产及其高附加值产品的研发等提供了技术支持。

近年来，有关植物材料粉碎粒度对有效成分提取率影响的研究报道较多，提高粉碎粒度有助于提高有效成分的提取率，但是针对不同的植物材料或有效成分，粉碎粒度与提取率之间并不完全呈正比关系[22]。特别是对于小分子有效成分，由于其容易从细胞壁中溶出，因此粉碎粒度的提高对有效成分的提取并无明显影响[23-24]。本研究所获得的CA提取工艺适用于0.63 mm雀嘴茶粉末的提取，其他粉碎粒度对雀嘴茶CA提取率的影响尚有待进一步研究。

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Optimizing the extraction of 6′-O-caffeoylarbutin fromVacciniumdunalianumby response surface methodology

LI Na,DAN Han-long,LIU Yun,LUO Xu-lu,HE Peng,KAN Huan,ZHAO Ping

(KeyLaboratoryforForestResourcesConservationandUseintheSouthwestMountainsofChina,MinistryofEducation,SouthwestForestryUniversity,Kunming,Yunnan650224,China)

Abstract:【Objective】 This study aimed to determine the optimal ultrasonicassisted extraction of 6′-O-caffeoylarbutin (CA) from Vaccinium dunalianum buds.【Method】 Ultrasonic-assisted extraction method was used to extract CA from V.dunalianum buds.The effects of methanol concentration (50%,60%,70%,80%,and 90%),liquid-material ratio (8∶1,10∶1,12∶1,14∶1,and 16∶1),ultrasonic time (10,15,20,25,and 30 min),and extraction times (1,2,3,4,and 5) on the extraction rate of CA were investigated by single factor experiments and the extraction process was optimized using response surface methodology. 【Result】 The theoretically optimum ultrasonic-assisted extraction conditions for CA were:methanol concentration 72.87%,liquid-material ratio 15.87∶1,ultrasonic time 18.96 min,and extraction number 3.63 times.Under this optimal condition,the predicted extraction rate of CA was 23.12%.According to the actual experiment,the above parameters were modified to methanol concentration 73%,liquid-material ratio 16∶1,ultrasonic time 19 min,and extraction number 4 times.The actual extraction rate of CA was 23.03%,which was close to the theoretical value. 【Conclusion】 It is feasible to use response surface method for optimization of ultrasonic-assisted extraction of CA from V.dunalianum buds.

Key words:Vaccinium dunalianum;6′-O-caffeoylarbutin;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

DOI：网络出版时间:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.024

[收稿日期]2014-10-24

[基金项目]国家自然科学基金项目(21462040，31460076)；西南林业大学科技创新基金项目(C1463)

[作者简介]李娜(1990-)，女，云南曲靖人，硕士，主要从事天然产物化学研究。E-mail:576909424@qq.com E-mail:hypzhao@yahoo.com

[通信作者]赵平(1965-)，男，重庆江津人，研究员，博士，博士生导师，主要从事天然产物化学研究。

[中图分类号]Q946.83+9；S571.109

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)06-0173-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.048.html