王　玲，唐德强，王佳佳，尚云青，刘铭琳，林　烨

(1 广东海洋大学 a 食品科技学院,b 农学院，广东 湛江 524088；2 云南中医学院，云南 昆明 650500)

铁皮石斛原球茎与野生铁皮石斛多糖的抗菌及体外抗氧化活性比较

王玲1a，唐德强1b，王佳佳1a，尚云青2，刘铭琳1a，林烨1a

(1 广东海洋大学 a 食品科技学院,b 农学院，广东 湛江 524088；2 云南中医学院，云南 昆明 650500)

[摘要]【目的】 比较铁皮石斛原球茎多糖与野生铁皮石斛多糖的抗菌及体外抗氧化活性，为铁皮石斛组织培养物的应用提供依据。【方法】 以大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白色念珠菌(Candida albicans)为供试菌，用抑菌圈法测定2种铁皮石斛多糖对目标菌的抗菌活性；分别用羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由基)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)法和硫代巴比妥酸法(TBA法)结合分光光度法检测2种铁皮石斛多糖清除 和DPPH·及抗脂质过氧化的能力，比较2种铁皮石斛多糖的抗菌及体外抗氧化活性。【结果】 铁皮石斛原球茎多糖与野生铁皮石斛多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均具有显著的抑制作用，且野生铁皮石斛多糖的抑菌效果比铁皮石斛原球茎多糖优；2种铁皮石斛多糖对 和DPPH·均有极显著的清除作用，对小鼠肝组织脂质过氧化均有极显著的抑制作用，且野生铁皮石斛多糖比铁皮石斛原球茎多糖效果更好，2种铁皮石斛多糖的抗菌及抗氧化活性与多糖质量均存在剂量效应关系。【结论】 与野生铁皮石斛多糖相比，铁皮石斛原球茎多糖在抗菌、抗氧化能力方面虽存在一定差距，但仍具有进一步开发的价值。

[关键词]石斛原球茎；野生铁皮石斛；抗菌活性；体外抗氧化活性

多糖(Polysaccharide)是一类存在于植物、动物和微生物中的天然活性物质，具有较强的抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫力等功能[1-3]。自由基(Free radical)是一些具有高度化学活性的原子、原子团或分子，在生物体内，许多功能障碍和疾病的发生都与自由基有密切关系[4]。

铁皮石斛(DendrobiumcandidumWall.ex Lindl)为兰科石斛属植物，是《中华人民共和国药典》中收录的名贵中草药之一，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳的功效[5]，现代药理学和植物化学研究表明，铁皮石斛主要的生物活性物质是多糖类化合物，且在植物界中其多糖类物质含量相对较高，抗氧化能力较强[6-9]。然而由于铁皮石斛的种子极小、无胚乳，生长条件苛刻，生长周期长，导致野生铁皮石斛的产量非常有限，加上长期过度采挖，目前野生铁皮石斛已濒临灭绝[10]。为实现铁皮石斛资源的可持续发展，近年来，云南、广西、广东等地的相关科研及技术部门已经利用植物细胞培养技术，获得了其组织培养物——铁皮石斛原球茎，为铁皮石斛植株的人工栽培提供了技术保障。但铁皮石斛原球茎多糖与野生铁皮石斛多糖在抗菌及体外抗氧化活性方面的差异尚不清楚，为此，本研究比较了铁皮石斛原球茎多糖与野生铁皮石斛植株多糖的抗菌及体外抗氧化活性，并分析二者的差异，以期为铁皮石斛组织培养物的进一步开发提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试材料铁皮石斛原球茎，由云南纳博生物技术有限公司提供，将铁皮石斛茎段诱导出的原球茎接种到改良的B5培养基中，28 ℃培养35 d；野生铁皮石斛采自云南普洱山区。

铁皮石斛多糖粗品自行制备，以料液比(体积比)1∶2的比例将经过破碎的铁皮石斛用90 ℃热水浸提3～4 h，浸提液浓缩至1/10体积时，用6倍体积的体积分数95%乙醇进行多次沉淀，所得沉淀经55 ℃干燥后即得铁皮石斛多糖粗品。

1.1.2试验菌种供试菌种为大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和白色念珠菌(Candidaalbicans)，均购自广东省微生物研究所。

1.1.3试验动物雄性昆明种小白鼠，体质量(20±2) g/只，购自昆明医科大学实验动物养殖中心。

1.1.4试剂和仪器盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、α-萘胺、三羟甲基氨基甲烷、硫代巴比妥酸、过氧化氢、硫酸亚铁等均为国产生化试剂或分析纯试剂；N,N,N,N-四甲基乙二胺、DPPH·为Sigma公司产品。

主要仪器有上海博迅电热恒温培养箱HPX-9162MBE、日立U-3010型紫外可见分光光度计Hitachi。

1.2方法

1.2.1铁皮石斛多糖抗菌活性测定取2种铁皮石斛多糖粗品用无菌水分别溶解成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL 5个梯度，将经过120 ℃干热灭菌的滤纸片放入其中浸泡0.5 h备用。

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，于30 ℃培养24 h进行活化；白色念珠菌接种于改良马氏琼脂培养基上，25 ℃培养2～3 d进行活化。然后在活化好的斜面试管中加入10 mL无菌生理盐水，振荡数次，洗下斜面上的细菌，制成106CFU/mL的菌悬液，然后取100 μL该菌悬液于相应的固体琼脂平板上，用无菌棒涂均匀，再分别将浸泡过多糖的滤纸片小心地平铺于上述涂菌平板上，距离适中，于30 ℃下培养48 h，观察有无抑菌圈形成，对有抑菌圈形成的试验组测定其直径，减去滤纸片的直径(6 mm)后记录结果。试验重复3次，结果取平均值。

1.2.2铁皮石斛多糖体外抗氧化活性测定(1)对羟基自由基(·OH)的清除能力。参考文献[11]的方法稍加改进。其原理是利用H2O2与Fe2+混合产生·OH，在体系中加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510 nm处有最大吸收。样品组试管中加入1 mL 0.15 mmol/L FeSO4、0.4 mL 2 mmol/L水杨酸、0.2 mL不同质量浓度的铁皮石斛多糖溶液、1 mL 6 mmol/L H2O2和 0.4 mL蒸馏水；空白组用蒸馏水代替铁皮石斛多糖溶液，对照组用蒸馏水代替水杨酸。将3组试管放入37 ℃水浴锅中，1 h后取出冷却，用蒸馏水调0，分别测吸光度A510，均设3个重复，取平均值。吸光度越小，表明对·OH的清除效果越好。以抗坏血酸(VC)作阳性对照，·OH清除率的计算公式为：

(3) 对自由基(DPPH·)的清除能力。DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，在 517 nm 处有吸收峰，呈紫色。当自由基清除剂存在时，DPPH·的孤电子被配对，颜色变浅，在最大吸收波长处吸光度变小。因此，测定DPPH·在体系中的吸光度变化可用来评价自由基(DPPH·)的清除情况[14]。

参照文献[15]和[16]的方法测定2种铁皮石斛多糖对DPPH·的清除能力，但有所改进。在样品管中加入0.5 mL不同质量浓度的铁皮石斛多糖溶液与2.5 mL体积分数0.004%的DPPH·溶液；对照管用体积分数 95% 乙醇代替DPPH·溶液；空白管用蒸馏水代替多糖溶液。以上3组试管均置于30 ℃水浴避光反应30 min 后，用0.5 mL蒸馏水和95%乙醇2.5 mL调0，分别测吸光度A517，试验重复3次取其平均值。以抗坏血酸(VC)作阳性对照。用下式计算铁皮石斛多糖对DPPH·的清除率:

(4)对小鼠肝组织脂质过氧化反应的影响。参照文献[17]的硫代巴比妥酸TBA法并有改进。小白鼠禁食15 h后颈椎脱臼处死，迅速取出肝脏，置4 ℃生理盐水中洗净血污，滤纸吸干后称质量，于冰浴中加9倍体积的冷生理盐水将肝组织制成质量分数10%的匀浆液，4 000 r/min 离心15 min，取上清液作为肝组织匀浆液置4 ℃冰箱中保存备用。

试验设自发氧化组、对照组、H2O2诱导组和FeSO4诱导组，对自发氧化组，分别向各试管中加入质量分数10%肝匀浆液0.20 mL和不同体积的铁皮石斛多糖溶液，无菌水补充体积至0.4 mL，对照组则以生理盐水替代铁皮石斛多糖溶液，各试管于37 ℃水浴1 h后，硫代巴比妥酸(TBA)比色法测吸光度A532，试验重复3次取平均值。A532值越大，表明肝组织中脂质过氧化物丙二醛(MDA)的含量越高。H2O2和FeSO4诱导组则分别先加入0.10 mL 10 mmol/L的H2O2和0.10 mL 5 mmol/L 的FeSO4，其他方法与自发氧化组相同。按下式计算抑制率：

1.3数据统计分析

2结果与分析

2.12种铁皮石斛多糖的抗菌活性

铁皮石斛原球茎多糖与野生铁皮石斛多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的抗菌效果见表1。

表 1　2种铁皮石斛多糖对不同供试菌的抑菌活性

从表1可以看出，2种铁皮石斛多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌都有不同程度的抑制作用，且抑菌强度随着多糖质量浓度的增加而增大；同样质量浓度下，野生铁皮石斛多糖比铁皮石斛原球茎多糖有更好的抗菌活性。

2.22种铁皮石斛多糖的体外抗氧化活性

2.2.1对·OH的清除效果从表2可以看出, 2种铁皮石斛多糖对羟基自由基(·OH)均有极显著的清除作用(P<0.01)，且清除能力与多糖的质量浓度存在一定的量效关系，即随着多糖质量浓度的增加，清除率增大；同时，野生铁皮石斛多糖的清除能力比铁皮石斛原球茎多糖强。铁皮石斛原球茎多糖对·OH的半数清除质量浓度(IC50)为1.162 mg/mL；野生铁皮石斛多糖的IC50为1.065 mg/mL。

表 2　2种铁皮石斛多糖对羟基自由基(·OH)的清除效果

注： **表示与对照相比，差异极显著(P<0.01)，下表同。

Note:** indicates extremely significant different (P<0.01) compared with control.The same below.

2.2.3对DPPH·自由基的清除效果由表4可见，2种铁皮石斛多糖对DPPH·自由基均有极显著的清除能力(P<0.01)，清除能力与清除效果呈明显的剂量效应关系；野生铁皮石斛多糖对DPPH·自由基的清除能力较铁皮石斛原球茎多糖强，其对DPPH·的IC50分别为0.525和0.621 mg/mL。

表 3　2种铁皮石斛多糖对超氧阴离子)的清除效果

表 4　2种铁皮石斛多糖对DPPH·自由基的清除效果

2.2.4对小鼠肝组织脂质过氧化反应的影响2种铁皮石斛多糖对小鼠肝组织脂质过氧化的抑制作用见表5。

表 5　2种铁皮石斛多糖对小鼠肝组织脂质过氧化的抑制作用

由表5可知，在自发氧化条件下，随着铁皮石斛多糖质量浓度的增加，A532逐渐减小，也即小鼠肝组织中脂质过氧化物丙二醛(MDA)的生成量逐渐减少，当各诱导组加入多糖后，MDA生成受到了不同程度的抑制，其抑制作用随铁皮石斛多糖质量浓度的增加而增强，并呈剂量效应关系，铁皮石斛原球茎多糖和野生铁皮石斛多糖对小鼠肝组织中脂质过氧化物丙二醛(MDA)的半数抑制质量浓度(IC50)分别为1.962和1.801 mg/mL；2种铁皮石斛多糖对Fe2+诱导组的抗氧化作用强于H2O2诱导组，可能是因为H2O2诱导体中产生的自由基强于FeSO4诱导组[19]。而且在试验范围内，自发氧化组、H2O2诱导组和FeSO4诱导组对小鼠肝组织脂质过氧化的抑制作用均极为显著(P<0.01)，说明2种铁皮石斛多糖对小鼠肝组织的脂质过氧化反应均有显著的抑制作用。

3讨论与结论

国内有学者分别对野生铁皮石斛的抗菌活性及铁皮石斛多糖和铁皮石斛原球茎多糖的抗氧化活性进行了研究，但都缺乏对相同条件下野生铁皮石斛多糖和实验室培养条件下生长的铁皮石斛原球茎多糖抗菌及抗氧化活性的比较研究，而二者之间的差异正是消费者关注的焦点。

综上可见，尽管铁皮石斛原球茎多糖与野生铁皮石斛多糖在抗菌、抗氧化能力方面还有一定差距，但与野生铁皮石斛相比，铁皮石斛原球茎具有栽培简单、生产周期短和成本低等优势，因此无论在抗菌、抗氧化功能还是产品开发方面，都有进一步研究和开发的价值。

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Comparison of antibacterial andinvitroantioxidant activities of polysaccharides fromDendrobiumcandidumprotocorms and wildDendrobium

WANG Ling1a,TANG De-qiang1b,WANG Jia-jia1a,SHANG Yun-qing2,LIU Ming-lin1a,LIN Ye1a

(1 aCollegeofFoodScienceandTechnology,bCollegeofAgriculture,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang,Guangdong524088,China;2TraditionalMedicinalCollegeofYunnan,Kunming,Yunnan650500,China)

Abstract:【Objective】 This study compared the antibacterial and antioxidant activities of polysaccharides of Dendrobium candidum protocorms and wild Dendrobium to provide basis for application of Dendrobium candidum tissue cultures.【Method】 Bacteriostatic ring method with Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,and Candida albicans was used to determine the antibacterial activity of polysaccharides.Combined with spectrophotometric method,the hydroxyl radical (·OH) system,superoxide anion free radical ) system,1,1-two phenyl-2-three nitro hydrazyl free radical (DPPH·) method and thiobarbituric acid (TBA) method were used to detect and compare their capability of scavenging (·OH), ) and (DPPH·) and anti-lipid peroxidation capability.【Result】 Both polysaccharides had significant inhibitory effects against Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis and Candida albicans.Inhibitory effect of polysaccharide from wild Dendrobium was stronger than that of polysaccharide from Dendrobium candidum protocorms.Both polysaccharides had significant scavenging effect on and DPPH· and significant inhibitory effect on lipid peroxidation in liver tissue of mice.Antioxidant effect of polysaccharide from wild Dendrobium was stronger than that of polysaccharide from protocorms of Dendrobium candidum.There was a dose effect relationship between antibacterial and antioxidant activities and polysaccharide concentration.【Conclusion】 The antibacterial and antioxidant abilities of polysaccharide from Dendrobium candidum protocorms were not as good as those of polysaccharide from wild Dendrobium.However,it is worthy to further develop polysaccharide from Dendrobium candidum protocorms.

Key words:Dendrobium candidum;wild Dendrobium;antibacterial activity;in vitro antioxidant activity

DOI：网络出版时间:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.023

[收稿日期]2014-10-24

[基金项目]国家自然科学基金项目(31070701)；地方高校国家级大学生创新训练项目(201410566010)

[作者简介]王玲(1965-)，女，云南昆明人，副教授，硕士生导师，主要从事食品微生物及食品加工技术研究。 E-mail:wl6509@163.com

[中图分类号]S567.23+9；TQ464.1

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)06-0167-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.046.html