吴佳玲，罗 丹，傅满姣，石国民，成 灿，潘建华

·诊治分析·

结核感染T细胞斑点试验、腺苷脱氨酶及结核杆菌抗体对结核性胸膜炎的诊断价值分析

吴佳玲，罗 丹，傅满姣，石国民，成 灿，潘建华

410004湖南省长沙市中心医院检验科

【摘要】目的分析结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、腺苷脱氨酶(ADA)及结核杆菌抗体(TB-Ab)对结核性胸膜炎(TBP)的诊断价值。方法选取长沙市中心医院胸科中心2015年3—11月收治的疑似TBP患者136例，其中明确诊断为TBP 114例(TBP组)，非TBP 22例(非TBP组)。比较两组患者胸腔积液常规检查结果、T-SPOT.TB阳性率、胸腔积液ADA和乳酸脱氢酶(LDH)浓度、TB-Ab阳性率，并分析T-SPOT.TB、ADA及TB-Ab对TBP的诊断价值。结果两组患者胸腔积液白细胞计数和淋巴细胞分数比较，差异无统计学意义(P>0.05)；TBP组患者胸腔积液抗酸染色阳性率高于非TBP组(P<0.05)。TBP组患者T-SPOT.TB阳性率、胸腔积液ADA浓度及TB-Ab阳性率均高于非TBP组(P<0.05)；两组患者胸腔积液LDH浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。以T-SPOT.TB、ADA及TB-Ab任意一项阳性为TBP的诊断标准，结果显示其灵敏度为98.24%、特异度为63.64%；以T-SPOT.TB阳性或ADA、TB-Ab两项结果阳性为TBP的诊断标准，结果显示其灵敏度为91.23%、特异度为81.81%。结论将T-SPOT.TB阳性或ADA、TB-Ab两项结果阳性作为TBP的诊断标准时，其诊断价值较高，灵敏度和特异度均较高。

【关键词】结核，胸膜；结核感染T细胞斑点试验；腺苷脱氨酶；结核分枝杆菌；抗体

吴佳玲，罗丹，傅满姣，等.结核感染T细胞斑点试验、腺苷脱氨酶及结核杆菌抗体对结核性胸膜炎的诊断价值分析[J].实用心脑肺血管病杂志，2016，24(5)：71-74.[www.syxnf.net]

Wu JL，Luo D，Fu MJ，et al.Diagnostic value of T-SPOT.TB，adenosine deaminase and TB-Ab on tuberculous pleurisy[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(5)：71-74.

目前，我国结核杆菌感染率在22个结核病高发国家中位居第二，仅次于印度，因此抗结核形势十分严峻[1]。结核性胸膜炎(tuberculous pleurisy，TBP)是结核杆菌及其自溶产物、代谢产物进入超敏感机体胸膜腔而引起的胸膜炎症，是一种常见的肺外结核。TBP无特异性临床表现，常需要借助实验室检查(如病原学检查、B超、X线等)进行确诊，但实验室检查也存在一些不足，如结核杆菌培养周期较长且阳性率较低，病理活检创伤较大，B超、X线检查特异度较低等，因此临床迫切需要探索一种诊断快速、准确且特异度和灵敏度均较高的方法。本研究分析了结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、腺苷脱氨酶(ADA)及结核杆菌抗体(TB-Ab)对TBP的诊断价值，旨在探究TBP的早期诊断方法。

1资料与方法

1.1一般资料选取长沙市中心医院胸科中心2015年3—11月收治的疑似TBP患者136例，其中男78例，女58例；年龄14～68岁；明确诊断为TBP 114例(TBP组)，非TBP 22例(非TBP组)。排除标准：HIV感染者，妊娠期妇女，自身免疫性疾病及肝肾功能衰竭者。

1.2诊断标准渗出液符合Light′s标准，即积液/血清乳酸脱氢酶(LDH)>0.6；积液/血清蛋白>0.5；积液LDH大于血液中LDH参考值上限的2/3。TBP的诊断标准：(1)临床症状：伴有发热、干咳、胸痛或呼吸困难；(2)体征：有胸腔积液体征；(3)影像学检查：X线表现、超声检查显示胸腔积液征象；(4)胸腔积液检查：积液为渗出液，白细胞计数增高，以淋巴细胞和单核细胞为主，ADA>45 U/L，胸腔积液ADA与血清ADA比值>1，胸腔积液涂片和/或培养结核分枝杆菌阳性；(5)结核菌素试验阳性；(6)胸膜活检：胸膜组织有典型的结核性病理改变；(7)排除其他原因引起的胸腔积液，且抗结核治疗有效[2]。

1.3主要仪器和试剂海尔BⅡ级生物安全柜，三腾DH-1605二氧化碳培养箱，可调式计数仪，日立7600生化仪，T-SPOT.TB试剂盒购自Oxford Immunotec Ltd，RPMI-1640及人外周血淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，ADA及LDH试剂盒购自宁波美康生物有限公司，结核分枝杆菌抗体IgG、IgM试剂盒购自潍坊康华生物技术有限公司，抗酸染色试剂盒购自湖南省天骑医学新技术有限公司。

1.4方法

1.4.1胸腔积液常规检查按照《全国临床检验操作规程(第4版)》检测胸腔积液白细胞计数、淋巴细胞分数，抗酸染色依据试剂盒说明书进行操作。

1.4.2T-SPOT.TB无菌抽取胸腔积液，肝素抗凝，1 800 r/min离心5 min，除去上清液，10 ml 1640重悬。悬液分成两份，分别按1∶1和1∶2的比例加入RPMI-1640和Ficoll淋巴细胞分离液，将RPMI-1640稀释后的血液样本缓慢倒入Ficoll淋巴细胞分离液中。将混合物分别以1 000×g、600×gg、350×g离心力离心3次，7 min/次，除去上清液后加入500 μl AIM-V培养液配制成细胞悬液，根据计数结果调节细胞浓度为 2.5×106/ml，分别在T-SPOT.TB板的阳性对照孔、抗原A孔、抗原B孔及空白对照孔中加入细胞液100 μl，5% CO2培养箱中37 ℃培养16～20 h。次日，用200 μl 磷酸盐缓冲液(PBS)洗板4次后，每孔加酶结合物50 μl，4～8 ℃孵育1 h。PBS洗涤4次，每孔加显色液50 μl，暗处静置7 min，加蒸馏水终止反应。彻底干燥后，可调式计数仪读取结果。结果判定：当空白对照孔内斑点数<6时，任一实验孔斑点数减去空白孔斑点数≥6即为阳性；空白对照孔斑点数>6，任一实验孔斑点数大于空白孔斑点数的两倍即为阳性(见图1)。

1.4.3ADA及LDH检测方法按照操作说明书设置上机参数，无菌抽取胸腔积液后，肝素抗凝，离心后取上清液检测ADA及LDH浓度，其中ADA>36.22 U/L可诊断为TBP。

1.4.4TB-Ab检测方法采用胶体金法检测结核分枝杆菌抗体IgG，先加1滴缓冲液于反应孔中，加待测血清150 μl，3滴金标液，最后加3滴洗涤液，3 min内观测结果，检测T区有红色印迹出现为阳性；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结核分枝杆菌抗体IgM，分别加100 μl稀释液、5 μl标本，37 ℃温浴10 min，洗涤5次后加50 μl酶结合物，温浴洗板后加显色液，酶标仪比色，OD值≥0.2为阳性。结核分枝杆菌抗体IgG和/或IgM阳性为TB-Ab阳性。

2结果

2.1胸腔积液常规检查结果两组患者胸腔积液白细胞计数和淋巴细胞分数比较，差异无统计学意义(P>0.05)；TBP组患者胸腔积液抗酸染色阳性率高于非TBP组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

表1两组患者胸腔积液常规检查结果比较

Table 1Comparison of routine examination results of pleural effusion between the two groups

组别例数白细胞计数(x±s,×109/L)淋巴细胞分数(x±s)抗酸染色阳性〔n(%)〕TBP组1140.58±0.120.55±0.1410(8.8)非TBP组 22 0.43±0.060.45±0.09 0 t(χ2)值1.6121.4365.240aP值0.1240.1680.022

注：a为χ2值；TBP=结核性胸膜炎

2.2T-SPOT.TB阳性率、胸腔积液ADA和LDH浓度、TB-Ab阳性率TBP组患者T-SPOT.TB阳性率、胸腔积液ADA浓度及TB-Ab阳性率均高于非TBP组，差异有统计意义(P<0.05)；两组患者胸腔积液LDH浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

2.3T-SPOT.TB、ADA及TB-Ab对TBP的诊断价值以T-SPOT.TB、ADA及TB-Ab任意一项阳性为TBP的诊断标准，结果显示其灵敏度为98.24%、特异度为63.64%，见表3。以T-SPOT.TB阳性或ADA、TB-Ab两项结果阳性为TBP的诊断标准，结果显示其灵敏度为91.23%、特异度81.81%，见表4。

表2两组患者T-SPOT.TB阳性率、胸腔积液ADA和LDH浓度、TB-Ab阳性率比较

Table 2Comparison of positive rate of T-SPOT.TB，ADA concentration and LDH concentration of pleural effusion，positive rate of TB-Ab between the two groups

组别例数T-SPOT.TB阳性〔n(%)〕ADA(x±s,U/L)LDH(x±s,U/L)TB-Ab阳性〔n(%)〕TBP组11493(81.6)46.37±10.15407.53±186.4178(68.4)非TBP组 22 4(18.2) 10.15±6.73309.59±174.853(13.6)t(χ2)值36.238a27.3411.43822.979aP值0.0000.0000.1690.000

注：T-SPOT.TB=结核感染T细胞斑点试验，ADA=腺苷脱氨酶，LDH=乳酸脱氢酶，TB-Ab=结核杆菌抗体；a为χ2值

注：图A为阳性结果，图B为阴性结果

图1　T-SPOT.TB结果判定

表4T-SPOT.TB阳性或ADA、TB-Ab两项结果阳性对TBP的诊断价值

Table 4Diagnostic value of T-SPOT.TB or both of ADA and TB-Ab on TBP

T-SPOT.TB阳性或ADA、TB-Ab两项结果阳性 金标准TBP 非TBP合计阳性1044108阴性101828合计11422136

3讨论

结核病是由结核分枝杆菌引起的感染性疾病，以肺结核较常见，但仍有15%～25%的结核病表现为淋巴结核、TBP、结核性脑膜炎等肺外结核。本研究结果显示，TBP组患者胸腔积液抗酸染色阳性率为8.8%，诊断价值较低，且由于TBP患者胸腔积液白细胞计数、中性粒细胞分数无特异性表现，因此胸腔积液常规检查不能及时诊断TBP。

γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays，IGRAs)是近年来发展起来的抗原特异性T细胞的检测方法，其检测原理为结核杆菌感染后引起细胞免疫反应，T细胞在初次感染致敏后成为记忆T细胞，当再次接触结核杆菌时活化增殖为效应T细胞，释放多种细胞因子，其中由辅助T淋巴细胞产生的γ干扰素是最关键的细胞因子。T-SPOT.TB以靶向抗原6 kD和滤过蛋白10 kD为特异性抗原，可刺激从外周血或体液分离的单个核细胞产生γ干扰素，再通过酶联免疫斑点技术计数特异性T细胞数目。这两种特异性抗原在RD1基因区进行编码，且该区域仅存在于结核分枝杆菌和少数致病性分枝杆菌的基因组中，两种抗原联合检测针对不同表位进行反应，从理论上保证了T-SPOT.TB的灵敏度和特异度。研究表明，TBP患者胸腔积液T-SPOT.TB的90.32%斑点数>50可能与趋化因子使感染部位局部淋巴细胞数增多有关[4]，但仍有18.42%检测阴性可能是由较多的潜伏感染所致[5]。

TB-Ab试验是将结核分枝杆菌抗原包被在固相载体上，与待测血清反应，血清中相应的抗体可结合于其上，再以胶体金(或酶)标志，显示反应，可检出血清中结核分枝杆菌抗体。

本研究旨在分析T-SPOT.TB、ADA、TB-Ab对TBP的诊断价值，首先将T-SPOT.TB、ADA、TB-Ab任意一项阳性作为TBP的诊断标准，其灵敏度为98.24%、特异度为63.64%，与其他研究结果相似[6-7]。高敏感度、低特异度虽不易漏诊，但易造成误诊；为了降低误诊率，本研究修改了联合检测TBP的诊断标准，改为T-SPOT.TB阳性或ADA、TB-Ab两项结果阳性作为TBP的诊断标准，其灵敏度为91.23%、特异度为81.81%，提高了特异度，从而降低了误诊率，与国外报道结果一致[8]。

综上所述，将T-SPOT.TB阳性或ADA、TB-Ab两项结果阳性作为TBP的诊断标准，其灵敏度和特异度均较高。但由于本研究样本量小、胸腔积液ADA对TBP的诊断临界值选择等均会导致结果出现一定偏差，因此仍需大样本量、前瞻性研究进一步证实。

参考文献

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(本文编辑：谢武英)

Diagnostic Value of T-SPOT.TB，Adenosine Deaminase and TB-Ab on Tuberculous Pleurisy

WUJia-ling，LUODan，FUMan-jiao，etal.

ClinicalLaboratory，theCentralHospitalofChangsha，Changsha410004，China

【Abstract】ObjectiveTo analyze the diagnostic value of T-SPOT.TB，adenosine deaminase(ADA)and TB-Ab on tuberculous pleurisy(TBP).MethodsFrom March to October in 2015，a total of suspected patients with TBP were selected in the Center of Chest，the Central Hospital of Changsha，thereinto 114 cased finally diagnosed as TBP were served as A group，while other 22 cases were served as B group.Routine examination results of pleural effusion，positive rate of T-SPOT.TB，ADA concentration and lactic dehydrogenase(LDH)concentration of pleural effusion，positive rate of TB-Ab were compared between the two groups，diagnostic value of T-SPOT.TB，ADA and TB-Ab on TBP were analyzed.ResultsNo statistically significant differences of white blood cell count or lymphocyte percentage of pleural effusion was found between the two groups(P>0.05)，while positive rate of acid-fast staining of A group was statistically significantly higher than that of B group(P<0.05).Positive rate of T-SPOT.TB，ADA concentration of pleural effusion and positive rate of TB-Ab of A group were statistically significantly higher than those of B group(P<0.05)，while no statistically significant differences of LDH concentration of pleural effusion was found between the two groups(P>0.05).Take either T-SPOT.TB，ADA or TB-Ab as diagnostic criteria for TBP，the sensitivity was 98.24%，the specificity was 63.64%；take T-SPOT.TB or both of ADA and TB-Ab as diagnostic criteria for TBP，the sensitivity was 91.23%，the specificity was 81.81%.ConclusionTake T-SPOT.TB or both of ADA and TB-Ab as diagnostic criteria for TBP，the diagnostic value is relatively high，with high sensitivity and specificity.

【Key words】Tuberculosis，pleural；T cell spot test for tuberculosis infection；Adenosine deaminase；Mycobacterium tuberculosis；Antibodies

基金项目：国家“十二五”传染病科技重大专项(2013ZX10005004)

通信作者：罗丹，410004湖南省长沙市中心医院检验科；E-mail：luodanfiles@163.com

【中图分类号】R 521.7

【文献标识码】B

doi:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.05.018

(收稿日期：2016-01-03；修回日期：2016-04-18)