王建　程雪娇　焦晓军　余贵菊　于小婷　王猛　曾振灵　曾东平

摘 要：为了科学、客观地评价干乳期利福昔明乳房注入剂在奶牛临床上应用的安全性，根据相关技术指导原则，分别进行家兔的皮肤刺激性试验、阴道刺激性试验及豚鼠主动皮肤过敏性试验，试验结果显示，利福昔明乳房注入剂给药部位的皮肤和生理盐水对照组都没有出现红斑和水肿，刺激强度的评分为0分；阴道刺激试验的试验组和对照组的阴道粘膜没有出现明显的白细胞浸润、充血和水肿现象，阴道粘膜刺激指数为0.25；在皮肤过敏性试验中，给药组动物皮肤未见红斑与水肿，各时间的皮肤刺激反应积分为0。因此，利福昔明乳房注入剂对家兔的皮肤和阴道无刺激性；对豚鼠不产生明显的皮肤过敏性反应。

关键词：利福昔明乳房注入剂；皮肤刺激；阴道刺激；主动皮肤过敏反应

中图分类号：S858.23 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.06.006

Study on LocalIrritation and Allergy Tests of Rifaximin Breast Implants

WANG Jian1， CHENG Xuejiao1， JIAO Xiaojun1， YU Guiju1， YU Xiaoting1，WANG Meng1， ZENG Zhengling2，ZENG Dongping2

（1. Tianjin Speerise Challenge Biotechnology Company Limited，Tianjin 300380，China；2. College of Veterinary Medicine， South China Agriculture University， Guangzhou 510640，China）

Abstract： In order to scientifically and objectively evaluate the safety of cows clinical application of rifaximin breast implants in the dry period， referring to the relevant technical specifications， rabbit skin irritation test， vaginal mucous membrane irritation test and guinea pig skin allergy test respectively was studied. The results showed that erythema and edema was not been found on rifaximin breast implants administration site skin and saline control site skin， and score of 0 points. In the vaginal mucous membrane irritation test， leukocyte infiltration， hyperemia and edema was not been found obviously in vaginal mucosa of test group and control group， vaginal mucous membrane irritation index was 0.25. In the skin allergy test， erythema and edema was not been found on test group， skin irritation in each time integral was 0. So， rifaximin breast implants had no irritation on rabbit skin and vaginal mucous membrane； guinea pigs do not produce significant allergic skin reaction after administration.

Key words： rifaximin breast implants； skin irritation； vaginal mucous membrane irritation； skin allergic reaction

利福昔明（rifaximin）是利福霉素的半合成衍生物，和其他利福霉素类抗生素类似，利福昔明通过和细菌DNA-依赖RNA聚合酶的β-亚单位发生不可逆的结合从而抑制细菌RNA的合成，防止了该酶与DNA连接，阻断RNA转录并最终抑制了细菌蛋白质的合成，本品抗菌谱广，抗菌活性强，对多种革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌、链球菌和棒状杆菌）、革兰阴性菌（大肠杆菌、巴氏杆菌、假单胞菌和变形杆菌等）均有高度抗菌活性[1-3]。目前，欧盟已批准利福昔明用于干乳期奶牛乳房炎和子宫内膜炎的治疗，欧盟规定利福昔明在牛奶中的残留标示物为原形药物，最高残留限量（MRL）为60 μg·kg-1。

利福昔明乳房注入剂（干乳期）是天津市中升挑战生物科技有限公司研制的新兽药，用于预防由金黄色葡萄球菌、链球菌及大肠杆菌引起的干奶期奶牛乳房炎。为了科学、客观评价天津市中升挑战生物科技有限公司研制的干乳期利福昔明乳房注入剂在奶牛临床上应用的安全性，现根据国家食品药品监督管理总局关于发布药物安全药理学研究技术指导原则等8项技术指导原则的通告（2014年第4号）附件4《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》[4]，及中华人民共和国农业部公告（第1247号）颁布的《兽药临床前毒理学评价试验指导原则》[5]，分别进行了家兔的皮肤刺激性试验、阴道刺激性试验以及豚鼠主动皮肤过敏性试验，对其进行临床前毒理学评价，预测临床用药的安全性，为临床试验提供参考。endprint

1 材料和方法

1.1 供试药品

利福昔明乳房注入剂（干乳期）：规格5.0 mL∶100 mg（以利福昔明计），批号120810，天津市中升挑战生物科技有限公司。

阳性对照药：2，4-二硝基氯苯，规格25 g，批号20130726，由天津市光复精细化工研究所提供。

阴性对照药：0.9%氯化钠注射液，规格500 mL：4.5 g，批号A10082202，由贵州天地药业有限责任公司生产。

1.2 试验动物

新西兰兔，普通级，体重2 kg左右，雌雄各半，由南方医科大学实验动物中心提供[SCXK（粤）2011-0015]。FMMU豚鼠，普通级，雌雄各半，体质量300 g左右，由南方医科大学实验动物中心提供[SCXK（粤）2011-0015]。动物购回后环境适应饲养3 d，采用自然光照，试验期间饲喂全价兔料，饮水充足、不受限制，室温控制在26 ℃，相对湿度为40%～70%。

1.3 试验方法

依据相关技术指导原则中的皮肤刺激性试验、阴道刺激性试验和主动皮肤过敏性试验方法[4-6]进行试验。

1.3.1 皮肤刺激性试验 将8只新西兰兔随机分为完整皮肤组（Ⅰ组）和破损皮肤组（Ⅱ组）两组，每组4只，雌雄各半。Ⅰ组试验开始前24 h将动物脊柱两侧对称部位用电动剃毛器各剃出面积为3 cm×3 cm的无毛区，将试验动物皮肤脱毛后，检查去毛区域是否有因去毛而导致的受伤，受伤皮肤不宜再进行刺激性试验。Ⅱ组破损皮肤是用7号针头（一次性消毒）按“#”字形划破已去毛消毒皮肤的表皮层，以出现渗血为标准，左右两侧皮肤的破损程度应基本保持一致。左侧为利福昔明乳房注入剂用药区，取0.5 mL涂布于左侧已经去毛的皮肤上，然后用纱布（2.5 cm×2.5 cm）和一层玻璃纸覆盖，再用无刺激性胶布固定，右侧为生理盐水对照区，贴敷时间为5 h，之后去掉受试物，用温水清洗用药部位的皮肤，连续用药3 d。在每次去除药物后1 h及再次贴敷前，仔细观察并记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉淀、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并参照皮肤刺激性反应评分标准进行评分（表1），采用同体左右侧自身对比。最后一次贴敷后，在去除药物后30～60 min，24，48，72 h各时间点来观察并记录是否有红斑和水肿等情况出现在涂敷部位。对评分较高或可疑的受试动物处死1只，进行病理组织学检查，并根据皮肤刺激性强度评价标准和病理学检查综合判定结果。多次给药的皮肤刺激性试验，先计算每个观察时间点的各组积分均值，再计算观察期限内的每天每只动物积分均值，并按照表2进行刺激强度评价。

1.3.2 阴道刺激性试验 8只雌性新西兰兔随机分为攻毒试验组和正常对照组两个组，每组4只。往攻毒试验组的阴道灌注2 mL的利福昔明乳房注入剂，往对照组动物的阴道灌注2 mL的生理盐水。攻毒后24 h，各组新西兰兔用空气栓塞法安乐处死，用手术剪剪开腹盆腔取出完整的阴道，纵向剖开，观察是否出现充血、水肿等病理现象，将出现充血、水肿等病理现象的阴道放入10%的福尔马林溶液中固定24 h以上，然后取阴道的两端和中央三个部位的组织制作病理切片，HE染色后，在显微镜下进行组织病理学观察。然后按粘膜刺激反应评分标准进行评分（表3），最后分值为每组的每一个观察时间每一动物的粘膜刺激反应分值相加得到的总积分除以这组的动物数。按粘膜刺激强度分级标准进行刺激强度分级（表4）判断其刺激程度。

1.3.3 主动皮肤过敏性试验 本试验采用同体自身对比法，致敏期间左侧给予利福昔明乳房注入剂，激发给药于右侧皮肤。取30只豚鼠，雌雄各半，随机分为阴性对照，阳性药物对照（2，4-二硝基氯苯）和利福昔明乳房注入剂3组，分别为1组，2组，3组。每组各10只豚鼠。致敏给药和激发给药分别于试验动物的左、右侧皮肤进行。致敏给药：在动物左侧脱毛区涂抹0.2 mL受试物，用医用薄纱布覆盖并固定住，以防止动物啃咬、损伤用药部位，保持6 h，并在第7 天和第14 天，重复上述试验，阴性对照组（生理盐水）与阳性药物对照组（0.1%的2，4-二硝基氯苯）的试验方法同致敏试验一致。激发给药：于末次给受试物致敏后14 d，在豚鼠背部右侧脱毛区涂抹0.2 mL受试物，6 h后去掉受试物并马上观察皮肤的过敏反应情况，并在24，48，72 h再次观察上述现象，并按表5对红斑和水肿进行评分，计算过敏反应的发生率，根据表6判断过敏反应发生程度。

2 结果与分析

2.1 皮肤刺激性试验

每日观察新西兰兔在3 d给药期及给药结束后3 d内的给药部位皮肤情况。试验结果显示出，利福昔明乳房注入剂在完整皮肤组和破损皮肤组的给药部位和对照部位（生理盐水）均未出现红斑和水肿现象，根据评分标准评为0分；也没有发现异常现象如药源性出血，色素沉淀以及皮肤粗糙。并且试验动物其他生理现象（饮水、饮食、排泄、外观、重量）也没有出现异常。根据国家有关皮肤刺激性试验皮肤反应评分及反应强度评价标准原则，利福昔明乳房注入剂（干乳期）对新西兰兔的完整皮肤和破损皮肤，均无刺激性反应，结果见表7。

2.2 阴道刺激性试验

用药期间，攻毒试验组和正常对照组家兔的全身状况均没有发现异常，阴道口也没有出现明显充血、红肿及异常分泌物流出。解剖并取出阴道组织进行肉眼观察，攻毒试验组的阴道有轻微的粘膜充血、水肿以及出血点现象，阴道粘膜刺激平均分为0.25，依据国家有关阴道粘膜刺激反应评分及反应强度评价标准，利福昔明乳房注入剂对家兔一次性阴道粘膜刺激强度为无刺激性。结果见表8。组织病理学检查结果见图1，2。

2.3 主动皮肤过敏性试验

在试验过程中，各组试验动物均未有严重的全身性过敏反应发生，如哮喘、站立不稳或休克等过敏现象。利福昔明乳房注入剂组在致敏后0，24，48，72 h致敏反应的平均值皆为0，空白对照组0，24，48，72 h致敏反应的平均分皆为0；阳性对照组2，4-二硝基氯苯致敏和激发期间均出现红斑和水肿，0，24，48，72 h致敏反应的平均分为5.7，4.6，5.0，5.7，按照国家有关皮肤过敏反应评分及过敏性评价标准，利福昔明乳房注入剂对豚鼠的皮肤为弱致敏性，结果见表9。

3 结 论

本试验严格按照国家食品药品监督管理总局发布的关于药物安全药理学研究技术指导原则等8项技术指导原则的通告（2014年第4号）附件4《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，及中华人民共和国农业部公告（第1247号）颁布的《兽药临床前毒理学评价试验指导原则》，进行家兔皮肤刺激性试验、阴道粘膜刺激性试验和豚鼠的皮肤过敏性试验，试验结果显示利福昔明乳房注入剂对家兔的皮肤和阴道粘膜无刺激性；对豚鼠不产生明显的皮肤过敏性反应。提示本品的应用安全性良好，临床使用安全，符合规范要求，值得临床上进一步推广应用。

参考文献：

[1]任淑萍，陈瑞玲.利福昔明的临床应用[J].临床药物治疗杂志，2005，3（6）：38-40.

[2]GASZTONYI B H B，Pharmacological Aspects of Rifaximin.Local antibiotic therapy in intestinal disorders[J].Orvosi hetilap，2004，145（43）：2177-2181.

[3]SCRASCIA M，FORCILLO M，MAIMONE F，et al.Susceptibility to rifaximin of Vibrio cholerae strains from different geographical areas[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2003，52（2）：303-305.

[4]药物刺激性.过敏性和溶血性研究技术指导原则[M].北京：国家食品药品监督管理局，2014.

[5]农业部兽药评审中心.兽药注册资料汇编[M].北京：农业部兽药评审中心，2009.

[6]化学品急性皮肤刺激性/腐蚀性试验方法. 中华人民共和国国家标准[S].北京：中国国家标准化管理委员会，2008.endprint