白方会，李 慧，姜婷婷，魏赈权，洪 新，陈宝田

·论著·

正天丸对偏头痛模型大鼠三叉神经二级神经元P2X3受体表达的影响研究

白方会，李 慧，姜婷婷，魏赈权，洪 新，陈宝田

510515广东省广州市，南方医科大学(白方会，魏赈权，洪新，陈宝田)；广州市红十字会医院中医科(李慧)；南方医科大学第五附属医院神经内科(姜婷婷)

【摘要】目的探究正天丸对偏头痛模型大鼠三叉神经二级神经元P2X3受体表达的影响。方法2014年9—10月选取SPF级SD雄性大鼠30只，采用随机数字表法分为3组，分别为对照组、模型组、正天丸组，每组10只。正天丸组大鼠给予1.62 g·kg-1·d-1正天丸灌胃，对照组和模型组大鼠给予1 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃，各组大鼠连续给药 7 d。模型组、正天丸组大鼠末次灌胃30 min后左侧肩部皮下注射10 mg/kg硝酸甘油注射液，制备实验性偏头痛动物模型，对照组大鼠同期左侧肩部皮下注射0.5 ml 0.9%氯化钠溶液。观察各组大鼠耳红出现、消失时间及挠头开始、结束时间等行为学表现，采用免疫荧光、Western blotting法、实时荧光定量PCR法检测各组大鼠三叉神经颈髓复合体(TCC)中P2X3受体及其mRNA表达水平。结果模型组和正天丸组大鼠耳红出现时间、挠头开始时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；正天丸组大鼠耳红消失时间和挠头结束时间均较模型组提前(P<0.05)。免疫荧光结果显示，对照组、模型组和正天丸组大鼠三叉神经TCC中均有P2X3受体阳性表达，主要分布在三叉神经脊束核尾部(TNC)和C1、C2颈髓背侧核浅层(Ⅰ、Ⅱ层)，模型组表达亮度较对照组升高，正天丸组表达亮度较模型组降低。模型组和正天丸组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体及其mRNA表达水平较对照组升高(P<0.05)；正天丸组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体及其mRNA表达水平较模型组降低(P<0.05)。结论正天丸对偏头痛的治疗作用可能与其可以抑制三叉神经二级神经元P2X3受体表达上调有关。

【关键词】偏头痛；三叉神经；神经元；正天丸；P2X3受体

白方会，李慧，姜婷婷，等.正天丸对偏头痛模型大鼠三叉神经二级神经元P2X3受体表达的影响研究[J].中国全科医学，2016，19(15)：1828-1832.[www.chinagp.net]

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偏头痛为一种突发性神经与血管功能障碍，以反复发作的单侧或双侧头部严重的搏动性疼痛为特点[1]。我国偏头痛年患病率女性为3.3%～32.6%，男性为0.7%～16.1%[2]。该病发病率高、治愈率低，目前缺乏安全有效的治疗措施，严重影响患者的生活质量，2010年全球疾病负担调查将偏头痛列为全球第七位高致残性疾病[3]。偏头痛的发病机制至今尚未完全阐明，三叉神经血管反射学说是目前研究偏头痛发病机制的主流学说，三叉神经血管系统的激活是偏头痛发生的关键环节，三叉神经脊束核尾部(trigeminal nucleus caudalis,TNC)和C1、C2颈髓背侧核统称为三叉神经颈髓复合体(TCC)[4]，是三叉神经二级神经元，当偏头痛发作时TCC兴奋性增高。P2X3受体属于配体门控型非选择性阳离子通道嘌呤能受体，其选择性高表达于处理伤害信息的感觉神经元上，丰富表达于三叉神经感觉核[5-6]。偏头痛发作时，三叉神经二级神经元P2X3受体表达水平明显上调[7-8]。以往实验研究表明，正天丸可以通过降低血管阻力、增加脑血流量、改善微循环、调节多种血管活性物质等，发挥抗偏头痛作用[9]。正天丸对P2X3受体表达的影响，目前尚不清楚。本实验通过观察正天丸对硝酸甘油诱发偏头痛模型大鼠三叉神经二级神经元P2X3受体表达的影响，探讨其对偏头痛的防治机制，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物2014年9—10月选取SPF级SD雄性大鼠30只，周龄9～11周，平均周龄(9.8±1.6)周；体质量250～300 g，平均体质量(280±20)g。大鼠由南方医科大学实验动物中心提供，饲养条件：室内温度 22～26 ℃，相对湿度40%～60%，光暗周期12 h，自由摄取充足的水和食物，动物模型制备前适应性喂养7 d。动物实验遵循国家科技部 2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求[10]。

1.2实验药物与试剂硝酸甘油注射液购于北京益民药业有限公司(药品批号：131122)，正天丸购于华润三九医药股份有限公司(药品批号：1308002H)，0.9%氯化钠溶液购于贵州天地药业有限责任公司(药品批号：A14050812)，10%水合氯醛(用量0.4 ml/100 g)为实验室自配，4%多聚甲醛溶液购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，P2X3兔多克隆抗体购于Santa Cruz Biotechnology，免疫荧光二抗-抗兔Cy3购于南京凯基生物科技发展有限公司，β-actin抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司，BCA试剂盒和ECL发光液购于碧云天生物技术研究所，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购于Millipore公司，SyBrⅠ实时荧光定量PCR检测试剂盒、MX3005P实时荧光定量PCR仪购于Stratagene公司，IS 2000 MM图像工作站购于Kodak公司。

1.3分组及偏头痛模型的建立采用随机数字表法将大鼠分为3组，分别为对照组、模型组、正天丸组，每组10只。3组大鼠周龄、体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。正天丸组大鼠给予1.62 g·kg-1·d-1正天丸灌胃(药物剂量根据成人常规每日口服剂量进行换算)；对照组和模型组大鼠给予1 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃。各组大鼠连续给药 7 d。模型组、正天丸组大鼠末次灌胃30 min后左侧肩部皮下注射10 mg/kg硝酸甘油注射液，制备实验性偏头痛动物模型[11]；对照组大鼠同期左侧肩部皮下注射0.5 ml 0.9%氯化钠溶液。

表1　3组大鼠周龄、体质量比较±s)

1.4行为学观察以大鼠出现耳红、前肢频繁挠头、烦躁不安等行为视为造模成功[12]。观察指标：(1)模型组和正天丸组大鼠皮下注射硝酸甘油注射液后耳红出现时间和耳红消失时间；(2)模型组和正天丸组大鼠皮下注射硝酸甘油注射液后挠头开始时间和挠头结束时间，其中挠头开始时间以大鼠出现连续挠头达5次及以上为标志，挠头结束时间以30 min内大鼠挠头次数不足5次且出现倦怠、疲乏状态为标志。

1.5标本采集与指标检测

1.5.1免疫荧光造模4 h后，各组采用随机数字表法取4只大鼠，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，经心尖部插管至升主动脉，剪开右心耳，4 ℃ 0.9%氯化钠溶液快速灌注至流出液清亮，继而用4%多聚甲醛溶液灌注固定，先快后慢，灌注至大鼠尾巴变僵硬。断头取延髓至上颈段脊髓(至C2)，放入4%多聚甲醛溶液固定24 h，次日依次放入10%、20%、30%蔗糖脱水至沉底。石蜡包埋切片，片厚10 μm。切片进行脱蜡和水化、热抗原修复、灭火内源性过氧化物酶后，滴加5%牛血清清蛋白(BSA)封闭液封闭15 min以封闭非特异性抗原，随后加入一抗—P2X3兔多克隆抗体(sc-25694，1∶500)，4 ℃环境下过夜。滴加免疫荧光二抗-抗兔Cy3(Cat:KGIF010，1∶500)，避光孵育1 h，每个环节间均用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，5 min/次，加抗淬灭剂，中性树胶封固，倒置荧光显微镜下观察结果，红色为标记的P2X3受体，对照组以PBS作为一抗。

1.5.2Western blotting法造模4 h后，各组采用随机数字表法取3只大鼠，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速冰上取延髓至上颈段脊髓(至C2)，-80 ℃液氮保存。将同组内所有样品进行等量混合以消除组内差异，取混合物50 mg进行液氮研磨，加入150 μl RIPA裂解液及1.5 μl 苯甲基磺酰氟(PMSF)冰上孵育30 min，4 ℃ 1 500 r/mim离心15 min(离心半径13.5 cm)，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。每个样本各取50 μg进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST冲洗3次，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，HRP偶联的山羊抗兔二抗(1∶3 000)室温孵育1 h，采用ECL化学发光法在IS 2000 MM图像工作站进行曝光拍照，Molecular Imaging Software Version 4.0(Kodak) 软件分析条带灰度值，以β-actin为内参，每组重复检测3次。

1.5.3实时荧光定量PCR法造模4 h后，各组剩余3只大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速冰上取延髓至上颈段脊髓(至C2)，-80 ℃液氮保存。按照SyBrⅠ实时荧光定量PCR检测试剂盒说明书进行各样本总RNA的提取和cDNA的转录，反转录条件为25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。以管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列如下：P2X3上游引物为5′-TCTTGAGGGTAGGGGATGTG-3′，下游引物为5′-CACACCCAGCCGATCTTAAT-3′； GAPDH上游引物为5′-ATTCTCAGCAATGCATC-3′，下游引物为5′-ATGGACTGTGGTCATGAGCC-3′。实时荧光定量PCR反应体系20 μl：蒸馏水(dH2O)7 μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，Taq酶10 μl。PCR反应条件：95 ℃ 10 s，58 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，共45个循环。采用MX3005P实时荧光定量PCR仪读取P2X3和GAPDH的循环阈值，采用相对定量法(2-ΔΔCT)计算各样本P2X3mRNA的ΔCT值：ΔCT值=目的基因CT值-内参基因CT值。每组重复检测3次。

2结果

2.1各组大鼠行为学表现对照组大鼠未出现耳朵发红，偶有挠头现象，模型组和正天丸组大鼠在造模4min左右均出现耳红、前肢频繁挠头及烦躁不安等行为。模型组和正天丸组大鼠耳红出现时间、挠头开始时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；正天丸组大鼠耳红消失时间和挠头结束时间均较模型组提前，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

Table 2Comparison of the appearing and disappearing time of red ear and the beginning and ending time of scratching head between model group and Zhengtian pills group

组别只数耳红出现时间耳红消失时间挠头开始时间挠头结束时间模型组104.0±0.8135.5±8.14.3±1.2137.3±6.1正天丸组103.8±0.9101.4±8.54.0±0.8101.5±6.1t值0.5149.1910.66913.076P值0.613<0.0010.512<0.001

2.2免疫荧光结果免疫荧光结果显示，对照组、模型组和正天丸组大鼠三叉神经TCC中均有P2X3受体阳性表达(红色荧光颗粒)，主要分布在TNC和C1、C2颈髓背侧核浅层(Ⅰ、Ⅱ层)，模型组表达亮度较对照组升高，正天丸组表达亮度较模型组降低(见图1，本文图1彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

注：A为对照组，B为模型组，C为正天丸组

图13组大鼠三叉神经TCC中P2X3的表达(免疫荧光，×100)

Figure 1Expression of P2X3in TCC among the three groups

2.3Western blotting法结果3组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中模型组和正天丸组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体表达水平较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；正天丸组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体表达水平较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表3、图2)。

Table3ComparisonoftheexpressionlevelofP2X3receptorinTCCofthethreegroups

组别P2X3受体对照组0.34±0.02模型组1.02±0.02a正天丸组0.84±0.06abF值225.795P值<0.001

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

图2Western blotting法检测3组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体的表达水平电泳图

Figure 2Electrophoregrams of expression level of P2X3receptor in TCC of the three groups detected by Western blotting method

2.4实时荧光定量PCR法结果3组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中模型组和正天丸组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体mRNA表达水平较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；正天丸组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体mRNA表达水平较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表4)。

表43组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体mRNA表达水平比较

Table 4Comparison of the mRNA expression of P2X3receptor in TCC among the three groups

组别P2X3受体mRNA对照组1.00±0.05模型组2.53±0.23a正天丸组1.39±0.42abF值48.296P值<0.001

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

3讨论

TCC作为偏头痛发病机制中三叉神经血管通路的二级神经元，可以将三叉神经末梢感受器传递而来的伤害性感受信息进一步传递到丘脑，直至大脑皮质，从而产生头痛，同时发出冲动刺激位于延髓的呕吐中枢引起恶心、呕吐表现[13]。

大鼠皮下注射硝酸甘油注射液后，其代谢产物一氧化氮(NO)能够诱导TNC中伤害性疼痛标志物Fos的表达，激活三叉神经血管系统，诱发偏头痛[14]。硝酸甘油诱发偏头痛大鼠模型具有造模方法简捷、模型间相似性好、对动物创伤小、易于复制、能在清醒状态下观察大鼠行为学表现等优点，是目前国内应用较成熟且普遍的偏头痛动物模型[15]。行为学表现是评价偏头痛造模成功的一项重要指标[9]，本实验大鼠皮下注射硝酸甘油注射液4 min左右即出现耳红、前肢频繁挠头及烦躁不安等行为，说明造模成功。

P2X3受体选择性高表达于处理伤害性信息的感觉神经元上[6]，具有较高的Ca2+通透性，可以介导多种急、慢性疼痛，已经成为疼痛治疗领域的新靶点[7]。激活三叉神经感觉核的P2X3受体可引起Ca2+内流，增加谷氨酸释放，以增强兴奋性突触传递并介导炎性反应的中枢敏化[16]。P2X3受体相关信号分子通过长时程逆行传递增加细胞体内环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)和其他分子的活化水平，从而保持神经元的活性和兴奋性，CREB活化有助于维持与慢性炎症相关的长期疼痛的敏感性[17]。本实验应用免疫荧光和Western blotting法检测各组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体表达水平，实时荧光定量PCR法检测各组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体mRNA表达水平，结果显示，对照组和模型组大鼠三叉神经TCC中均有P2X3受体阳性表达，模型组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体及其mRNA表达水平较对照组升高。文献报道，P2X3受体初级传入纤维呈弥散型终止于吻侧三叉神经感觉核(包括三叉神经感觉主核、三叉神经脊束核脊间亚核和吻侧亚核)，呈密集型终止于三叉神经脊束核尾侧亚核浅层，主要位于其胶状质[5]；P2X3受体在野生型小鼠感觉神经元亦有较低水平的表达，但在家族性偏瘫型偏头痛Ⅰ型转基因模型小鼠三叉神经感觉神经元呈组成型上调状态[18]，三叉神经感觉神经元P2X3受体表达水平上调与偏头痛发作有相关性[19-21]。本研究结果证实，皮下注射硝酸甘油注射液可以成功模拟偏头痛的发作，激活了三叉神经血管系统，并通过上调三叉神经TCC中P2X3受体的表达水平，介导偏头痛的发生、发展。

正天丸是由中医治疗头痛4大古方(川芎茶调散、麻黄附子细辛汤、桃红四物汤、四藤消震饮)中的15味中草药组成的中药复方制剂，具有疏风活血、养血平肝、通络止痛等功效，是目前临床治疗偏头痛的主要中成药之一[22]。临床随机、双盲、多中心、对照研究显示，正天丸能减轻偏头痛患者的发作强度、程度，减少发作频率，缩短头痛持续时间，临床疗效确切，患者耐受性好，且无明显不良反应[23]。正天丸对偏头痛模型大鼠症状的改善类似于氟桂利嗪[9]。本研究结果显示，正天丸组大鼠耳红消失时间和挠头结束时间均较模型组提前，表明正天丸可以降低偏头痛的持续时间。文献报道，正天丸可以升高实验动物血浆及脑干中5-羟色胺(5-HT)水平，降低血浆中降钙素基因相关肽(CGRP)、内皮素(ET)、NO水平[9,24]。本实验结果显示，正天丸组大鼠三叉神经TCC中P2X3受体及其mRNA表达水平均较模型组降低，说明正天丸可以抑制偏头痛发作时三叉神经TCC中P2X3受体的表达，从而发挥抗偏头痛的作用。

综上所述，三叉神经二级神经元P2X3受体表达上调介导了偏头痛的发作，正天丸可以通过降低偏头痛模型大鼠三叉神经二级神经元P2X3受体的过表达从而起到治疗偏头痛的作用，为其临床疗效提供了有力的理论依据。但偏头痛的发病机制较复杂，目前对于正天丸对偏头痛发作时脑内神经递质影响方面的研究较少，有待进一步深入研究其对P2X3受体的作用机制及对其他神经递质的干预作用，从而更全面更深入地了解正天丸的抗偏头痛机制。

作者贡献：白方会进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；李慧、姜婷婷、魏赈权、洪新进行实验实施、评估、资料收集；陈宝田进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

Effect of Zhengtian Pills on P2X3Receptor Expression in Secondary Neurons of Trigeminal Nerve of Rat Model of Migraine

BAIFang-hui,LIHui,JIANGTing-ting,etal.

SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Zhengtian pills on P2X3 receptor expression in secondary neurons of trigeminal nerve of rat model of migraine.MethodsFrom September to October in 2014,we selected 30 SPF grade Sprague-Dawle(SD) male rats and using the random number table method divided them into three groups:control group,model group and Zhengtian pills group,with 10 rats in each group.Rats of Zhengtian pills group was given 1.62 g·kg-1·d-1Zhengtian pills by gavage,rats of control group and model group were given 1 m 0.9% sodium chloride solution by gavage.The drug administration lasted for 7 days.In model group and Zhengtian pills group,migraine rat models were established by subcutaneous injection of nitroglycerin(10 mg/kg) at the left shoulder at 30 min after the last drug administration.Rats of control group were given 0.5 ml 0.9% sodium chloride solution by subcutaneous injection at the left shoulder.Behavioural performances of the rats were observed,including the appearing and disappearing time of red ear and the beginning and ending time of scratching head.Immunoflourescence,Western blotting and Real-time PCR were used to detect the expressions of P2X3 receptor and its mRNA in trigeminocervical complex(TCC).ResultsModel group and Zhengtian pills group were not significantly different in the appearing time of red ear and the beginning time of scratching head(P>0.05).Zhengtian pills group had earlier disappearing time of red ear and earlier ending time of scratching head than model group(P<0.05).Immunofluorescence results showed that the expression of P2X3 receptors in TCC was positive in the rats of each group,mainly distributed in the TNC andⅠ,Ⅱ layer of C1,C2 cervical spinal dorsal nucleus,and the expression of model group was higher than control group and Zhengtian pills group.The expression levels of P2X3 receptor and its mRNA in TCC of model group and Zhengtian pills group were higher than those of control group(P<0.05),while the expression levels of P2X3 receptor and its mRNA of Zhengtian pills group were lower than those of model group(P<0.05).ConclusionThe effect of Zhengtian pills on the treatment of migraine may be related with its inhibition on the expression of P2X3 receptors in secondary neurons of trigeminal nerve.

【Key words】Migraine disorders；Trigeminal nerve；Neurons；Zhengtian pills；P2X3 receptors

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81202687)；广东省科技计划项目(2012B061700018)；广东省中医药管理局科研课题(20141218)

通信作者：陈宝田，510515广东省广州市，南方医科大学；E-mail:gy33mail@126.com

【中图分类号】R 747.2

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.15.018

(收稿日期：2015-12-03；修回日期：2016-02-16)

·中医·中西医结合研究·