顾磊，蒋春晖，孙隆慈，刘晔，周鸿，许春杰，徐庆

（上海交通大学医学院附属仁济医院 胃肠外科，上海 200127）



1，25（OH）2D3体外抑制小鼠Th17细胞分化的作用研究

顾磊，蒋春晖，孙隆慈，刘晔，周鸿，许春杰，徐庆

（上海交通大学医学院附属仁济医院 胃肠外科，上海 200127）

［摘 要］目的 探讨1，25（OH）2D3对Th17细胞分化的体外抑制作用。方法 通过对分离出的脾淋巴细胞进行CD4+T细胞分选，将不同浓度的1，25（OH）2D3加入到CD4+T细胞中并在诱导因子的作用下诱导其分化。通过ELISA检测培养上清中IL-17A和IL-22的浓度；流式细胞仪分析Th17细胞的比例及RT-PCR检测Th17细胞分化的转录因子的表达。结果 培养上清ELISA检测显示：与对照组相比，1，25（OH）2D3组的IL-17A和IL-22浓度随着加入1，25（OH）2D3浓度的增大而呈现逐渐降低的现象，差异且具有统计学意义（P＜0.01）；流式结果显示：诱导分化后对照组Th17细胞比例最多，1，25（OH）2D3组处理后Th17细胞比例降低，且呈剂量依赖性；RTPCR检测显示：与对照组相比，1，25（OH）2D3组IL-17A、IL-22，RORγt和RORα表达量随着剂量的增加而逐渐降低，并具有统计学意义（P＜0.01）。结论 体外实验表明，1，25（OH）2D3具有抑制Th17细胞分化的作用，表现为Th17细胞比例、分泌的细胞因子及特异的转录因子表达均减少。

［关键词］肝纤维化；1，25-二羟基维生素D3；Th17；小鼠

众所周知，1，25（OH）2D3在免疫调节、细胞增殖和分化、抗纤维化等各种生物过程中可发挥重要作用［1］。1，25（OH）2D3可抑制免疫细胞的增殖和免疫球蛋白的产量，且能阻止B细胞前体细胞分化成浆细胞［2］。此外，1，25（OH）2D3抑制T细胞的增殖，特别是Th1细胞产生干扰素和IL-2的能力，激活巨噬细胞和Th17细胞产生IL-17和IL-22［3-4］。近年来，越来越多的文献报道指出，1，25（OH）2D3在治疗各种免疫疾病中与其调节获得性免疫密切相关。Correale等［5］发现，1，25（OH）2D3在治疗多发性硬化症的过程中，在维持T细胞的内稳定方面起着重要的作用。在活化和静止的T细胞中，1，25（OH）2D3诱导维生素D3受体（vitamin D receptor，VDR）的表达且大量抑制新鲜分离的CD4+T细胞和特异性髓鞘碱性蛋白T细胞的增殖。而且1，25（OH）2D3提高IL-10进行性细胞的发育，并减少IL-6和IL-17分泌细胞的数量。最后，1，25（OH）2D3增加吲哚胺2，3-二氧酶的基因表达和生物活性，并显著调节增加Treg细胞的数量。Takeda等［6］发现，口服1，25（OH）2D3可以通过改变树突状细胞和Treg的功能与分化，来防止动脉粥样硬化病情的发展。Tang等［7］发现，1，25（OH）2D3通过抑制Th17反应来抑制固有免疫应答，包括树突状细胞支持Th17细胞引发的能力、将CD4+T细胞变为Th17细胞群的能力和Th17细胞产生IL-17的能力。Chang等［8］证明，在体外1，25（OH）2D3通过维生素D3受体信号抑制产生IL-17的Th17细胞和Treg细胞的分化。1，25（OH）2D3通过减少IL-2的数量来调节Treg细胞的产生，但对Th17细胞无效。1，25（OH）2D3通过抑制Th17细胞的分化和迁移来防止实验性自身免疫性脑脊髓炎的发生、发展。显然，这些研究似乎都与1，25（OH）2D3抑制Th17细胞有关，其主要的作用机制可能就是通过对Th17的抑制来影响获得性免疫相关疾病的发生、发展。体内实验结果表明，1，25（OH）2D3对可能是通过抑制Th17细胞和Th1细胞的增殖来发挥其对肝纤维化的治疗作用。本实验目的在于研究体外1，25（OH）2D3对Th17细胞分化的抑制作用。

1　材料和方法

1.1实验动物和主要试剂

1.1.1实验动物：8周龄健康C57小鼠30只，购于常州卡文斯实验动物有限公司，由仁济医院实验动物中心提供喂养条件，适应性喂养7 d后进入实验阶段。1.1.2 主要试剂：1，25（OH）2D3，国药集团化学试剂有限公司；Trizol试剂，美国Invitrogen公司；刺激剂混合物（PMA/Ionomycin/Brefeldin A/Monensin）、重组人细胞因子（TGF-β、IL-6、IL-1β），以色列ProSpec公司；Percoll分离液，天津TBD公司；RPMI1640培养液，美国Hyclone公司；CD4、IL-17A、IL-2、CD3/CD28、IFN-γ一抗，英国Abcam公司；ELISA试剂盒（IL-22、IL-17A），BIOSH公司；SYBRGreen PCR试剂盒、逆转录试剂盒，美国Thermo公司，CD4+T细胞分选试剂盒，美国Selleck公司。

1.2实验方法

1.2.1诱导Th17细胞分化：无菌条件下，剖取小鼠脾脏组织；研磨后200目尼龙网过滤，离心5 min，收集细胞；8 mL PBS重悬细胞沉淀，将细胞悬液与40%的分离液混合，缓慢加到70%分离液上，离心20 min；吸取两层溶液之间的白细胞就能获得淋巴细胞；磁珠分选初始CD4+T细胞（按试剂盒说明书操作）；用含10%的胎牛血清RPMI1640培养CD4+T细胞，加入抗人CD3/CD28单抗、抗人IL-2、IFN-γ单抗和重组人细胞因子（TGF-β、IL-6、IL-1β），分为4组：对照组、1，25（OH）2D3低剂量组（1×10-9mol/L）、1，25（OH）2D3中剂量组（1×10-8mol/L）、1，25（OH）2D3高剂量组（1× 10-7mol/L），培养过程中按照以上分组加入等量不同浓度的的1，25（OH）2D3，对照组加入等量的PBS液；5 d后收集细胞及培养上清备用。

1.2.2流式细胞仪分析：将制备的各组脾脏淋巴细胞加入RPMI1640培养基中培养；加入终浓度为2 μL/mL的刺激剂混合物，恒温孵育5 h；取100 μL分配流式管内，加入5 μL的CD4 mAb，避光30 min；样品加入固定破膜剂，避光30 min；洗涤2次，样品中加入5 μL IL-17A mAb，避光孵育30 min；洗涤2次，24 h上机检测各组Th17细胞比例。

1.2.3细胞上清ELISA检测：根据试剂盒要求，用ELLSA法检测各组细胞上清液中IL-17A和IL-22的浓度。

1.2.4RT-PCR：采用Trizol法抽提中RNA；逆转录生成cDNA；RT-PCR扩增；数据采用仪器自带软件（ABI Prism 7500 SDS Software）分析，对RORγt与RORα的表达量进行相对定量。

1.3统计学分析

采用Origin 6.1软件进行统计学分析，正态分布的计量资料用（±s）来表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示有统计学意义。

2　结果

2.11，25（OH）2D3对Th17细胞分化的影响

图1为Th17细胞诱导分化过程中不同浓度1，25（OH）2D3作用后，流式细胞仪检测Th17细胞比例。从结果可以看出，无1，25（OH）2D3干预时（对照组），Th17细胞比例最高（62.9%），当1，25（OH）2D3干预后，Th17细胞比例降低，并且具有剂量效应，即Th17细胞比例随着1，25（OH）2D3干预浓度增加而逐渐减少。

2.21，25（OH）2D3影响细胞因子的分泌

图1　1，25（OH）2D3对Th17细胞诱导分化的干预

Th17细胞可特征性分泌IL-17，同时也分泌IL-22炎症性细胞因子，对两种细胞因子的检测结果（图2）显示：与对照组相比，1，25（OH）2D3作用下IL-17A和IL-22的表达减少，随着1，25（OH）2D3浓度逐渐升高呈现逐渐降低的趋势，且差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

2.3转录因子及细胞因子的mRNA水平

RT-PCR结果（图3）显示：细胞因子IL-17A和IL-22的mRNA水平变化与ELISA检测结果一致，即两者mRNA在对照组中表达最高，随着1，25（OH）2D3作用浓度的增加，IL-17A和IL-22的mRNA表达逐渐降低，并且具有显著差异（P＜0.01）。RORγt与RORα是Th17细胞的特异性转录因子，在对照组中，经过诱导刺激物的诱导，Th0细胞向Th17细胞分化，RORγt与RORα的mRNA表达量较高，细胞在诱导分化过程中给予1，25（OH）2D3作用后，转录因子表达量明显下降且具有剂量依赖性，与对照组相比，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。

图2　细胞因子IL-17A和IL-22的浓度

图3　Th17细胞特异转录因子及细胞因子的mRNA表达

3　讨论

Th17细胞是近年来发现的一种不同于Th1和Th2细胞，能够分泌IL-17的辅助性T细胞［9］，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义［10］。通过分泌IL-17A/F、IL-22、IL-23等炎症相关细胞因子来参与机体防御胞外感染、抗寄生虫免疫、自身免疫疾病和肿瘤发病等重要生理或病理进程，尤其在银屑病发病机制研究中，Th17细胞的作用受到广泛关注［11-13］。因此，Th17细胞分化和免疫功能调控的研究具有重要的基础研究及临床应用价值。有研究表明，初始T细胞在TGF-β和IL-6共同作用下分化为Th17细胞，T细胞分化为Th17细胞后可高表达RORγt、IL-17F，而RORγt和RORα双突变将导致Th17细胞分化彻底停止，并抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎的发生和发展［14］。Peng X等［15］发现，TH17细胞分泌的TH17细胞因子通过RANTES介导的白细胞浸润对肾纤维化有促进作用。1，25（OH）2D3是类固醇激素之一，是维生素D3在体内的活性形式，主要通过其特异性受体-VDR介导发挥生物学效应［16］。有研究发现肝脏中存在VDR，并且在肝脏中丰富的Kupffer细胞与HSC等均有VDR表达［17-18］。邓文升等［19］发现1，25（OH）2D3通过减少TGF-β1的表达以及抑制HSC的激活，抑制肝纤维化发展。而且维生素D与诸多肝脏疾病关系密切，如非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、病毒性肝炎、肝细胞肝癌等。因此，1，25（OH）2D3可能与肝纤维化发生密切相关，本研究采用目前认为较好的Th17细胞体外诱导分化的方法，在培养液中同时加入CD3/CD28、IFN-γ、IL-2和重组人细胞因子（TGF-β、IL-6、IL-1β），其中CD3/CD28单抗为CD4+T细胞的增殖提供活化信号，IL-2和IFN-γ单抗可有效防止CD4+T细胞向Th1、Th2细胞分化，而重组人细胞因子可以高效诱导CD4+T向Th17细胞分化。本研究发现对照组的Th17细胞分化明显（Th17细胞比例最高），细胞因子IL-17A和IL-22、转录因子RORγt和RORα的表达也最高，但在1，25（OH）2D3干预后表达都呈现下降趋势，表明1，25（OH）2D3可有效地抑制Th17细胞的分化。这说明1，25（OH）2D3可有效地调节T细胞的免疫反应，通过对T细胞的平衡调节来参与治疗肝纤维化等疾病。

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（本文编辑：鲁翠涛）

·经验交流·

Inhibition effect of 1，25（OH）2D3on TH17 cell differentiation in mice in vitro

GU Lei， JIANG Chun-hui， SUN Long-ci， LIU Ye， ZHOU Hong， XU Chun-jie， XU Qing. Department of Gastrointestinal Surgery，Renji Hospital Affiliated to School of Medicine， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200127， China

AbstractObjective To study and confirm the inhibition effect of 1，25（OH）2D3on Th17 cells differentiation in vitro. Methods Lymphocytes were separated from spleen. Different concentrations of 1，25（OH）2D3were added to the CD4+T cells. Th17 cell differentiation was induced by CD4+T Cell Isolation Kit. The level of IL-17A and IL-22 were detected by ELISA. Flow cytometry was used to analyze the proportion of Th17 cells while RT-PCR was used to detect the expression of transcription factors of th17 cells. Results Cytokines detection in culture supernatant by ELISA showed that IL-17A and IL-22 concentrations gradually decreased， with an increasing addition of 1，25（OH）2D3concentration. The proportion of Th17 cells reduced in 1，25（OH）2D3treatment group and presented a dose dependent. The mRNA levels of IL-17A， IL-22， RORγt and RORα were significantly decrease in 1，25（OH）2D3treatment group than that in control group （P＜0.01）. Conclusion 1，25（OH）2D3plays a role in inhibiting the differentiation of Th17 cells， reduces the cytokines secretion （IL-17A and IL-22） and expression of specific transcription factors（IL-17A， IL-22， RORγt， RORα）.

Key wordsliver fibrosis； 1，25（OH）2D3； Th17； mice

［通讯作者简介］徐庆，主任医师，博士，E-mail：renjixuqing@163.com。

［第一作者简介］顾磊（1981-），男，浙江宁波人，主治医师，在读博士。

［基金项目］上海市卫生和计划生育委员会科研课题（20154Y0207）。

［收稿日期］2015-12-28

［中图分类号］R575

［文献标识码］A

DOI：10.11952/j.issn.1007-1954.2016.03.010