叶乐驰，郑春晓，金约朋，白永愉，李强，周蒙滔

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325000，1.肿瘤外科；2.肝胆外科）



区域动脉灌注5-FU诱导大鼠急性胰腺炎腺泡细胞凋亡及Caspase-3表达

叶乐驰1，郑春晓2，金约朋2，白永愉2，李强2，周蒙滔2

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325000，1.肿瘤外科；2.肝胆外科）

［摘 要］目的 探讨区域动脉灌注（regional arterial infusion，RAI）5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）对大鼠急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）胰腺腺泡细胞凋亡的影响及其对急性胰腺炎的治疗作用。方法 18只健康成年SD大鼠随机分成3组：对照组（C组）、急性胰腺炎组（AP组）和5-FU治疗组（5-FU组）。各组均行胃左动脉置管，AP组和5-FU组以大剂量雨蛙素（每小时腹腔注射50 μg/kg，连续6 h）诱导建立大鼠急性胰腺炎模型，对照组注射同等剂量的生理盐水。5-FU组在第一次腹腔注射雨蛙素1 h后立即区域动脉灌注5-FU（40 mg/kg）治疗，C组和AP组区域动脉灌注等量的生理盐水。建模成功后3 h取标本并处死大鼠，检测血淀粉酶浓度，RT-PCR法检测胰腺组织内TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平，胰腺标本送病理学检查，Western blotting法检测胰腺组cleaved Caspase-3的蛋白表达，同时TUNEL法检测大鼠胰腺腺泡细胞凋亡情况。结果 与AP组比较，5-FU组血淀粉酶浓度明显降低（P＜0.05）；胰腺组织内TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平下降（P＜0.05）；胰腺组织病理学改变减轻；胰腺组织cleaved Caspase-3的蛋白表达增加；胰腺腺泡细胞凋亡增加（P＜0.05）。结论 区域动脉灌注5-FU对大鼠急性胰腺炎有改善作用，其作用机制可能与诱导胰腺腺泡细胞凋亡有关。

［关键词］急性胰腺炎；凋亡；5-氟尿嘧啶；区域动脉灌注；雨蛙素；大鼠

尽管近年来针对急性胰腺炎（AP）的治疗有所改进，但病死率高、并发症多、治疗费用高昂的治疗现状仍未见明显改观［1］。5-FU治疗AP取得了肯定的疗效［2-6］，但是缺乏深入的机制研究。本实验通过建立雨蛙素诱导的大鼠AP模型，从胰腺腺泡细胞凋亡的角度去探讨5-FU对AP的治疗机制。

1　材料和方法

1.1材料和试剂

清洁级健康成年雄性SD大鼠，体重250～300 g，购于温州医科大学实验动物中心。5-FU注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；雨蛙素（美国Sigma公司）；亚甲兰染色液、HE染色剂（北京索莱宝科技有限公司）；戊巴比妥钠（上海试剂总公司）；PE10导管（宁波安莱软件与器械有限公司），大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6引物序列（上海生工合成）。

1.2动物分组与建模

雄性SD大鼠18只，术前禁食12 h，不禁水。常规1.5%戊巴比妥钠针（1 mg/kg）腹部皮下注射麻醉。三组均麻醉后开腹，行胃左动脉置管［7］后引出体外固定，术后5 h清醒后诱导胰腺炎模型。（1）对照组（C组）：给予腹腔内注射等量的生理盐水；（2）急性胰腺炎组（AP组）：依照Bhatia等［8］方法建立大鼠AP模型，大剂量雨蛙素（caerulein）50 μg/kg，每隔1 h腹腔注射，连续6 h，总计6次，诱导建立大鼠急性胰腺炎模型；（3）5-FU治疗组（5-FU组）：同上雨蛙素制模，第1次雨蛙素皮下注射后1 h，行5-FU胃左动脉区域动脉灌注。5-FU动脉灌注剂量40 mg/kg，灌注速度6.0 mL/h。C组和AP组相同的时间给予胃左动脉灌注等量的生理盐水。大鼠清醒后自由饮水，禁食。

1.3标本采集及指标检测

各组建模完成后3 h，分别再次麻醉大鼠，抽血、取标本，检测如下指标：（1）血清淀粉酶，采用日本Beckman Coulter全自动生化仪检测；（2）RT-PCR法检测胰腺组织内TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA表达水平。TNF-α上游引物序列5′-ACTGAACTTCGGGGTGATTGG-3′，下游引物序列5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′；IL-1β

1.4统计学分析

2　结果

2.1胰腺组织光镜观察

光镜下，C组大鼠胰腺结构基本正常。AP组胰腺腺体结构紊乱，胰腺间质水肿，部分腺泡细胞空泡化，伴有大量炎症细胞浸润。5-FU组较AP组胰腺间质水肿、腺泡细胞空泡化、炎症细胞浸润均明显减轻，图1。

2.2胰腺组织病理学评分

AP组胰腺病理学评分最高，提示胰腺的损伤最严重。区域动脉灌注5-FU后，胰腺病理损伤程度减轻，病理学评分减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。5-FU组血清淀粉酶浓度较AP组有明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。具体见表1。

2.3胰腺组织TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平

采用RT-PCR法检测胰腺组织TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA表达水平。与C组比较，AP组和5-FU组胰腺组织内TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平均明显的升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。5-FU组胰腺组上游引物序列5′-CACCTTCTTTTCCTTCATCTTTG-3′，下游引物序列5′-GTCGTTGCTTGTCTCTCCTTGTA-3′；IL-6上游引物序列5′-TGATGGATGCTTCCAAACTGGA-3′，下游引物序列5′-GAGCATTGGAAGTTGGGGTA-3′；内参为大鼠GAPDH。（3）取部分胰腺置于4%多聚甲醛溶液中固定用于HE染色。HE染色法观察胰腺组织改变；（4）采用末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。凋亡指数（apoptotic index，AI）计算方法：取4个高倍镜视野，每个视野中计算250个腺泡中凋亡细胞数，AI=（凋亡细胞总数/1 000）×100%；（5）Western blotting法检测胰腺组织cleaved Caspase-3蛋白表达水平；（6）按照Schmidt标准［9］对胰腺进行病理评分，由有经验的病理科医师双盲进行评分，根据胰腺间质水肿、腺泡细胞坏死、出血和脂肪坏死、炎症细胞浸润进行评分，每项按照严重程度分别评分为0～4分。织TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平较AP组明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图1　大鼠胰腺组织光镜观察（HE，×200）

表1　各组胰腺病理学评分和血淀粉酶浓度

表2　各组胰腺组织TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达水平

2.4胰腺腺泡细胞凋亡的改变

TUNEL法检测胰腺腺泡细胞的凋亡，细胞核中深褐色的胰腺腺泡细胞为凋亡的细胞。各组的胰腺腺泡细胞凋亡指数（%）分别如下：C组（0.37±0.082）较少发生凋亡，凋亡指数低；AP组（1.12±0.26）凋亡指数较C组明显增加，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；5-FU组（2.5±0.39）胰腺腺泡细胞凋亡较AP组明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.5胰腺组织Caspase-3蛋白表达的变化

采用Western blotting法检测胰腺组织cleaved Caspase-3蛋白表达，结果如图3所示。AP组中Caspase-3水平明显高于C组，而5-FU组中Caspase-3水平较AP组明显升高。该结果提示胃左动脉区域动脉灌注5-FU后Caspase-3表达增加。

图2　大鼠胰腺TUNEL法显示胰腺腺泡细胞的凋亡（TUNEL，×100）

图3　胰腺组织Cleaved Caspase-3蛋白表达情况

3　讨论

胰腺腺泡细胞病理损害的结果主要有凋亡和坏死两种［10］。发生AP后，若胰腺腺泡坏死，细胞内多种胰酶成分被释放，可导致胰腺局部强烈的炎症反应进而激活全身炎症系统，从而诱发全身炎症反应综合征（systemic inflammatory reaction syndrome，SIRS）。若胰腺腺泡细胞凋亡，由于细胞膜的完整性，使得腺泡细胞内的胰酶成分不外泄，则不伴有或仅有轻微的炎症反应，引起的胰腺炎病变亦较轻，也不致发生SIRS。胰腺腺泡的损害方式（凋亡或坏死）决定了炎症级联反应的程度。坏死可促进炎症细胞的聚集和激活，释放炎症介质，诱发“瀑布样”的炎症级联反应，加重胰腺炎；凋亡有利于限制炎症的过度激活［10］。因此，如果我们能够诱导胰腺腺泡细胞发生凋亡，减少坏死，则有可能抑制炎症反应的的启动及其引发的SIRS。

自上世纪70年代5-FU就被用于治疗AP［11-12］，疗效肯定［2-6，13］。研究发现，5-FU以线粒体依赖和非依赖途径诱导细胞凋亡均伴随Caspase-3活化［14］，进而激活下游的酶和蛋白，引起细胞凋亡。与本实验研究结果与此相一致，区域动脉灌注5-FU伴随胰腺腺泡细胞Caspase-3的激活和胰腺腺泡的凋亡。

我们采用区域动脉灌注5-FU的方法作为诱导胰腺局部腺泡细胞凋亡的手段，除上述5-FU能诱导凋亡的原因之外，主要考虑区域动脉灌注途径能大幅提高胰腺组织局部药物浓度而不相应增加其全身毒副作用的优点［3］。Cao Y等［14］证实诱导胰腺腺泡细胞凋亡有利于减轻AP的严重程度。Orabi等［15］在大鼠胰腺炎模型中发现：腺泡细胞发生凋亡时胰腺炎相对较轻，认为凋亡可使胰腺腺泡细胞免除坏死，减低AP的严重性。由此看来，胰腺腺泡细胞的凋亡对AP病程进展是一种有益的反应。

本实验结果显示，区域动脉灌注5-FU可降低AP大鼠血淀粉酶浓度和胰腺组织TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平，减轻胰腺病理损伤，说明通过区域动脉灌注5-FU对雨蛙素诱导的AP起到治疗作用。区域动脉灌注5-FU使得胰腺腺泡细胞Caspase-3表达增加。区域动脉灌注5-FU使得胰腺腺泡细胞的凋亡增加。凋亡是细胞主动的死亡，是有基因控制的细胞程序性死亡。Caspase家族成员在凋亡的过程中起到了关键作用，其中Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，它在凋亡信号转导的许多途径中发挥功能［16-17］。结合我们的实验结果，推测5-FU可能通过增加Caspase-3表达，诱导胰腺腺泡细胞凋亡增加，进而对AP起到治疗作用。

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（本文编辑：张和，鲁翠涛）

·论著 基础研究·

Effect of 5-fluorouracil administered with regional arterial infusion on pancreatic acinar cell apoptosis and expression of Caspase-3 in rats with acute pancreatitis

YE Le-chi1， ZHENG Chunxiao2， JIN Yue-peng2， BAI Yong-yu2， LI qiang2， ZHOU Meng-tao2.1Department of Oncological Surgery；2Department of Hepatobiliary Surgery， The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， Zhejiang 325000， China

AbstractObjective To assess the effects of 5-fluorouracil （5-FU） administered with regional arterial infusion （RAI） on pancreatic acinar cell apoptosis of acute pancreatitis （AP） and its effect on AP in rats. Methods Eighteen male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into 3 groups: control group （C group）， acute pancreatitis group （AP group）， and the 5-FU treatment group （5-FU group）. A catheter was inserted through the left gastric artery in all the three groups. AP model was induced by hourly intraperitoneal injections of saline containing a supramaximally stimulating dose of caerulein （50 μg/kg） for 6 h. 5-FU （40 mg/kg） was administered with RAI to the 5-FU group following 1 h after the first intraperitoneal injection of caerulein. Saline was administered with the same doses to the other two groups. Serum amylase activity and mRNA levels of TNF-α， IL-1β，IL-6 in pancreatic tissues were measured with RT-PCR at 3 h following the induction of AP. The pathological changes in the pancreas tissues were observed and scored. Protein expression of cleaved Caspase-3 in pancreatic tissues was measured with Western blotting analysis. Apoptosis was quantified by TUNEL assay. Results Compared with the AP group， the serum amylase activity， the mRNA levels of TNF-α， IL-1β， IL-6 in pancreatic tissues and the pathological scores of pancreas in the 5-FU group decreased significantly （P＜0.05）. Expression of cleaved Caspase-3 in pancreatic tissues and pancreatic acinar cell apoptosis in the 5-FU group increased sig-book=206,ebook=35nificantly than that in the AP group （P＜0.05）. Conclusion RAI with 5-FU has beneficial effects on AP rats， the underlying mechanism is possibly related to indue pancreatic acinar cell apoptosis.

Key wordsacute pancreatitis； apoptosis； 5-fluorouracil； regional arterial infusion； caerulein； rats

［通讯作者简介］周蒙滔，主任医师，博士生导师，E-mail：zmt0417@hotmail.com。

［第一作者简介］叶乐驰（1979-），男，浙江温州人，主治医师，博士。

［基金项目］浙江省自然科学基金（LY12H03007）；国家自然科学基金（81370563）；浙江省医药卫生重大科技计划（WKJ2012-2-033）；浙江省科技厅公益性应用项目（2012C23108））；温州市科技局项目（H20110016）。

［收稿日期］2015-12-24

［中图分类号］R576

［文献标识码］A

DOI：10.11952/j.issn.1007-1954.2016.03.008