李　慧

(湖北民族学院附属民大医院皮肤科，湖北　恩施　445000)



白藜芦醇下调Cyclin家族表达调节皮肤癌HS-4细胞的增殖

李慧

(湖北民族学院附属民大医院皮肤科，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的探讨中药白藜芦醇(Res)对人皮肤癌HS-4细胞增殖的调节作用。方法利用MTT实验筛选Res对人皮肤癌HS-4细胞的最适作用浓度，对细胞的增殖情况进行测定；利用流式细胞技术观察Res对人皮肤癌HS-4细胞增殖周期产生的影响；采用Real-time PCR检测某些周期相关因子的mRNA表达；Western印迹检测某些周期相关蛋白改变情况。结果Res对人皮肤癌HS-4细胞毒性存在明显的正相关关系，其中20 mg/L的Res作用72 h对人皮肤癌HS-4细胞的增殖抑制率达到最大；加入Res处理48 h 后人皮肤癌HS-4的G0/G1期细胞数目明显比对照组多(P<0.05)，S 期细胞数目比对照组低(P<0.05)，G2/M期细胞数目两组差别不明显；Real-time PCR和Western印迹检测某些周期相关因子均发生明显改变。结论Res可抑制HS-4细胞增殖,其机制可能是其能影响皮肤癌HS-4细胞周期，将其阻滞于G1期，为Res在皮肤癌中应用提供基础。

〔关键词〕白藜芦醇；皮肤癌；细胞周期

皮肤癌主要包括鳞状细胞癌和基底细胞癌〔1〕，近年来发病率越来越高〔2,3〕。白藜芦醇(Res)是一种植物抗毒素，广泛存在于多种植物中。许多研究发现Res有多种生物活性，如抗氧化、改善微循环以及抗感染等〔4〕。Res对多种肿瘤都有一定的治疗作用，例如乳腺癌、肝癌、胃癌及肺癌等〔5～8〕。本实验旨在通过研究Res对皮肤癌HS-4细胞生长的调节作用，明确其对皮肤癌是否也具有抗肿瘤作用。

1材料与方法

1.1药物和制剂Res(美国Sigma公司,纯度>99%)，用二甲基亚砜(DMSO)溶解,0.22 μm尼龙滤膜过滤除菌,母液质量浓度为100 g/L,-20℃避光保存。HS-4细胞购自美国ATCC，胎牛血清、Trypin-EDTA 及DMEM培养液购于美国Gibco 公司，MTT、DMSO 购于国药集团化学试剂有限公司，细胞周期检测试剂盒(中国上海贝博生物有限公司)，一抗及二抗购自武汉三鹰公司，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris碱、TEMED、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、吐温-20(Tween-20)购于上海生工生物工程公司。电化学(ECL)显影液west Femto 及ECL west Pico 显影液购于美国Pierce 公司，TRIzol 试剂购于美国Invitrogen 公司。逆转录试剂盒购于美国Fermentas 公司，Real-time PCR试剂盒购于日本Takara 公司。

1.2仪器化学发光仪(美国GE Healthcare，型号LAS4000)，超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司，型号ZHJH-C1109B )，移液器(美国Eppendorf 公司)，垂直电泳仪(美国Bio-Rad 公司，型号165-3301 )，荧光定量PCR 仪(美国Stratagene 公司，型号Mx3000P)，CO2细胞培养箱(美国Thermo 公司，型号Forma 3111)。

1.3方法

1.3.1细胞培养HS-4细胞生长于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于 5%CO2、37℃恒温培养箱中培养传代。用含0.02% EDTA的0.25% 胰酶消化液消化细胞，并进行传代，传至4、5代左右，选取生长状态良好、增殖旺盛的细胞用于研究。

1.3.2MTT法检测人皮肤癌HS-4细胞的增殖取生长状况良好的对数期细胞进行消化，轻柔吹匀，调整为密度为3×104～3.5×104个/ml的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200 μl，每组每个时间点设置3个重复孔，培养6 h后，实验组加入含有Res成分的培养基，并在0 h的实验组和对照组每孔中加入20 μl的MTT。反应4 h后，弃液，加入150 μl DMSO，置于摇床上匀速摇30 min，待结晶完全溶解后，用空白调零，利用自动酶标仪测定490 nm下各孔的光吸收值，实验组的抑制率= 1 - A实验组/A对照组× 100%。

1.3.3流式细胞术分析细胞周期取生长状态良好的HS-4细胞，接种于6 孔板内，每孔2×104个/ml，加入2 ml培养基。置于37℃，5% CO2的培养箱中培养过夜，换成无血清的培养基，培养12 h使细胞周期同步化。当细胞达50%融合时，加入2.00 mg/L的 Res，培养48 h后，收集培养的细胞2 000 r/min离心15 min，重悬于200 μl 4℃预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中，缓慢轻柔的加入600 μl 75%的预冷的乙醇，对细胞进行悬浮固定，4℃过夜。离心弃乙醇，500 μl PBS重悬细胞，加入RNaseA至终浓度100 μg/ml，37℃水浴30 min，碘化丙啶(PI，20 μg /ml)染色30 min，上机检测，利用Mod Fit LT软件分析细胞周期。

1.3.4Real-time PCR检测某些周期相关因子的表达检测加入Res后HS-4细胞中P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D mRNA 的相对表达量。抽提RNA，并将其逆转录合成cDNA。反应条件:42℃ 60 min，70℃ 10 min。以反转录反应产物cDNA 为模板，使用Real-time PCR检测P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D mRNA 的相对表达量，每个样品设置3个复孔。内参照为GAPDH。实时PCR反应条件:95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共39个循环。溶解曲线条件:95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃15 s。根据反应结束后的Ct 值(每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所对应的循环数)，通过2-△△Ct法计算样品中多种mRNA 的相对表达量〔3〕，所得产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证。

1.3.5Western印迹分析将对照组和Res组培养至对数生长期，细胞按2×104个/孔的数量加入6孔板中，培养72 h后，用PBS洗涤3次，用细胞刮收集细胞，12 000 r /min离心30 min，收集上清。抽提总蛋白，测定蛋白浓度，然后加入5×loading，95℃浴煮10 min。40 μg蛋白进行凝胶电泳，用湿式转膜仪将凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上，5%的脱脂牛奶封闭60 min，将PVDF膜用TBST洗涤2次，10 min/次。分别加入相应抗体，内参用鼠抗人GAPDH，4℃孵育过夜后弃去一抗，用TBST洗涤3次×15 min。再分别加入辣根酶标记的二抗，室温孵育1 h后弃抗体，然后用TBST 洗涤3次，每次15 min。化学发光仪使用ECL 显影液进行显影。以GAPDH作为内参。

1.4统计学方法采用SPSS18.0软件行t检验。

2结果

2.1Res对HS-4细胞增殖的抑制作用Res可明显抑制HS-4细胞的增殖，药物浓度为20 mg/L、时间为72 h对细胞增殖影响变化最明显 (见图1)。

图1　Res对HS-4细胞增殖的影响

2.2Res对细胞周期的影响20 mg/L的Res作用48 h后可对人皮肤癌HS-4细胞的细胞周期产生明显的阻滞作用，影响了HS-4细胞周期各时相的分布，G0/G1期细胞比例(89.0%±4.41%)显著高于助溶剂DMSO对照组(80.8%±2.84%)(P<0.01)，S 期细胞比例(6.14%±0.63%)显著低于对照组(13.34%±1.22%)(P<0.01)，G2/M期细胞比例(4.86%±1.69%，5.87%±2.41%)无显著性差异。

2.3Western印迹检测细胞周期相关蛋白表达采用兔抗P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D单克隆抗体，选取GAPDH为内参，运用Western印迹检测20.00 mg/L Res处理细胞72 h后抽提的蛋白与对照组中相应蛋白的表达情况，P21 表达上调，PCNA 表达下调，Cyclin 家族Cyclin A、Cyclin B及Cyclin D均表达下调，见图2。

图2　Western印迹检测周期相关因子

2.4Real-time PCR检测某些周期相关因子的表达20 mg/L的Res作用48 h后，周期相关因子P21、PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D mRNA 的相对表达量均发生明显改变(分别为2.8、0.51、0.24、0.37、0.32，对照组设为1)，细胞周期阻滞在G1期。

3讨论

Res化学名称为 3，4'，5-三羟基芪，1940年第一次从毛叶叶黎芦(veratrum grandiortua O.Loes)的根部分离获得〔9〕。众所周知，生长信号的异常活化将进一步导致细胞增殖异常的发生〔10〕。随着进一步研究发现，肿瘤共性在于其无限性生长，而众学者认为这种无限增殖行为的产生可能是细胞周期紊乱导致〔11〕。因此，我们可以认为肿瘤是一种细胞无限性生长导致的细胞疾病〔12〕。大量研究显示，Res 可以预防和缓解癌症、心血管疾病等多种疾病〔13〕。Res 对多种癌症都有不同程度的拮抗作用，如胃肠道癌、生殖器官癌、结直肠癌等〔14～16〕。因此，Res被认为是目前最有望进入临床的天然抗癌药之一。

本研究结果推测20.00 mg/L的Res可能是其最大值，浓度越高，彼此之间有重叠，反而削弱了其增殖抑制作用。流式结果显示，经Res处理后细胞周期阻滞在G1期，细胞增殖速度慢，DNA合成量减少，从而大大降低肿瘤细胞数目。Real-time PCR 和Western印迹对细胞周期相关因子的检测结果也表明Res处理后细胞阻滞在G1期，P21表达水平上调明显，PCNA、Cyclin A、Cyclin B、Cyclin D表达水平均下调明显，出现明显的抑制增殖趋势。

综上所述，20.00 mg/L Res处理人皮肤癌HS-4细胞能够显著抑制HS-4细胞的恶性增殖，减少肿瘤数目，从而为皮肤癌的诊治提供新的思路，有望成为皮肤癌治疗的新方法，值得在临床推广。

4参考文献

1王平，毕志刚.UVB诱发皮肤癌的分子机制研究进展〔J〕.国外医学·皮肤性病学分册，2005;31(1):44-6.

2李立，白雪涛.紫外线辐射对人类皮肤健康的影响〔J〕.国外医学·卫生学分册，2008;35(4):198-201.

3Housman TS,Feldman SR,Williford PM,etal.Skin cancer is among the most costly of all cancers to treat for the medicare population 〔J〕.Am Acad Dermatol,2003;48(1):425-9.

4李琦，沙焕臣，马清涌，等.白藜芦醇对大鼠重症急性胰腺炎胰腺组织COX-2和iNOS表达的影响〔J〕.西安交通大学学报(医学版)，2009;30(1):14-6．

5郭慧琳，张献全.白黎芦醇抑制乳腺癌细胞增殖的机制研究〔J〕.中国肿瘤临床，2011；38(23):1424-6.

6曹泉.白藜芦醇对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响〔J〕.中南药学，2009；7(8):605-8.

7金松，辛国荣，孟繁石，等.白藜芦醇诱导人胃癌SGC7901细胞凋亡的研究〔J〕.黑龙江医药科学，2009；32(4):4-5.

8韩志远,张慧,杨巧媛.白藜芦醇抑制p60肺癌细胞的增殖作用研究〔J〕.中国热带医学，2014；14(1):12-5.

9向敏,匡小东.白黎芦醇及其药理保健功能的研究〔J〕.中国食品添加剂,2004；5:16-20.

10Araki S.TGF-β1-induced expression of human Mdm2 correlates with late-stage metastatic breast cancer〔J〕.J Clin Invest,2010;120(1):290-302.

11Dai M,Al-Odaini AA,Arakelian A,etal.A novel function for p21Cip1 and acetyltransferase p/CAF as critical transcriptional regulators of TGFβ-mediated breast cancer cell migration and invasion〔J〕.Breast Cancer Res,2012;14(5):R127.

12Anders L.A systematic screen for CDK4/6 substrates links FOXM1 phosphorylation to senescence suppression in cancer cells〔J〕.Cancer Cell,2011;20(5):620-34.

13Baur JA,Ainclair DA,Paul F.Therapeutic potential of resveratrol:the in vivo evidence 〔J〕.Nat Rev Drug Discov,2006;5(6):493-507.

14高倩，彭琼，甘惠中，等.白藜芦醇对 BGC-823 胃癌细胞株增殖抑制作用的体外研究〔J〕.胃肠病学和肝病学杂志，2014;23(10):1131-3.

15王清莹，姜飞洲，庄玉玉，等.白藜芦醇对人子宫内膜癌细胞系AN3CA增殖和凋亡效应及其机制探讨〔J〕.现代生物医学进展，2011;11(13):2401-4.

16任建琳，季青，陈文婷，等.白藜芦醇防治结直肠癌的研究进展〔J〕.国际消化病杂志，2014;34(1):48-51.

〔2015-07-26修回〕

(编辑李相军)

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)08-1802-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.005

第一作者：李慧(1978-)，女，硕士，主治医师，主要从事皮肤性病研究。