张丽 李霆格 杨文汉 曾媛 李婧 梅晶晶 赵安瑾 王健

摘 要 茶树油具有良好的抑菌能力，在果蔬天然保鲜杀菌剂的开发中具有良好的应用前景。采用滤纸扩散法测定不同浓度的茶树油对香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌的离体抑制效果。结果显示，茶树油对这2种菌都具有良好的抑菌效果，且浓度增加，抑菌作用逐渐增强，对芒果炭疽菌和香蕉炭疽菌的EC50分别为339.13和143.10 μL/L。

关键词 茶树油 ；香蕉炭疽菌 ；芒果炭疽菌 ；抑菌率

分类号 S789；TQ658 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.03.011

Abstract Tea tree oil has good prospects in development and application of natural fresh-keeping preservatives in fruits， vegetables for its ability of anti-microbial effect. In this research in vitro inhibition effect of tea tree oil on Colletotrichum musae and C. gloeosporioides under different concentrations were studied with filter paper dispersion method. The results showed that the tea tree oil had significant inhibition on mycelial growth of the two fungi. As the concentration increased， the antimicrobial activity increased accordingly. The results of experiment revealed the EC50 of tea tree oil on C. gloeosporioides and C. musae were respectively 339.13 μL/L and 143.10 μL/L.

Keywords tea tree oil ； Colletotrichum musae ； Colletotrichum gloeosporioides ； antimicrobial rate

茶树油（Tea tree oil，TTO） 是指取自于桃金娘科（Myrtaceae）白千层属（Melaleuca L.）的数种植物的精油，其中最主要的一种为互叶白千层（M. alternifola），故又称为互叶白千层油，“茶树油”是其商业名称[1]。茶树油是一种无色或浅黄色液体，具有令人愉快的豆蔻气味[2]。茶树油具有广谱抗菌、抗真菌、抗病毒和抗炎活性[3]，对痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes，G+）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccus aureus，G+）、表皮葡萄球菌（Staphyloccusepidermidis，G+）具有较强的抑制作用[1]。它无毒、无腐蚀，且不会把细菌、病毒、微菌杀死，只是适当的抑制其生长[4]，其药用价值使得它在外科、牙科和妇科临床上都得到了广泛应用[5]。

香蕉炭疽病是香蕉果实采后最主要的病害之一，是由香蕉炭疽菌[C. musae （Berk. & Curt.） Arx.]引起，该病菌具有潜伏性，在香蕉幼果期就可侵入果实果皮内部，直至果实成熟，症状才开始显现，如果不采取防治措施，会造成果实大量腐烂，严重影响香蕉的果实品质和食用价值[6]。

芒果炭疽病是芒果生产中发生最普遍、危害性最大的一种真菌病害，是由芒果炭疽菌（C. gloeosporioides Pens）引起。该病害具有潜伏性，芒果在幼果期染病后，病菌以侵染丝在果皮中滞育，不会引发症状，果实成熟时或储运期间才陆续表现症状，感病部分会出现不规则的黑色斑块，与未感病部分有明显的分界，会微下陷且有裂痕，最后导致果实变黑腐烂，严重影响果实的产量和品质[7]。

炭疽病是热带蔬果采后的一种重要病害之一。目前，对于蔬果仍以化学杀菌剂为主，但长期使用化学杀菌剂不仅会使病菌产生抗药性，而且农药残留还会导致环境污染及威胁人类健康等。因此，研究安全有效的防治措施势在必行，其中生物防治是目前最有应用前景的措施之一[8]。茶树油是世界公认的抗菌较好的植物精油[1]，它以一种膜破坏剂的形式发挥作用，通过破坏膜的结构，使得细胞的形态发生改变，从而达到抑菌的效果[9]。朱德明等[10]采用琼脂培养基扩散法研究茶树油对芭蕉炭疽病菌的抑制作用。结果发现，0.05%浓度的茶树油对其有明显抑制效应。但是由于茶树油不易溶于水，采用琼脂培养基扩散法可能会降低抑菌效果。本研究利用滤纸扩散法，测定茶树油对芒果炭疽菌和芭蕉炭疽菌的抗菌效果，为利用茶树油研制高效、低毒、绿色热带蔬果的抗病剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

茶树油由海南大学园艺园林学院实验室提供。

1.1.2 供试菌种

香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌由海南大学园艺园林学院实验室提供。

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g；葡萄糖20 g；琼脂20 g；去离子水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌落直径和抑菌率测定

选直径为9 cm的无菌培养皿，倒入PDA培养基，冷却凝固后接入菌种。待菌丝长满培养皿，用直径为0.8 cm的打孔器在上述菌落边缘切下带菌培养基。将平板倒置，取一张直径为9 cm的无菌滤纸置于皿盖中央，吸取不同体积的茶树油滴于滤纸片上，使其浓度分别为60、120、180、240、300、360 μL/L，用于香蕉炭疽病菌的测试；再吸取不同体积的茶树油滴于滤纸片上，使其终浓度分别为50、100、200、300、400、500 μL/L，用于芒果炭疽病菌的测试。以滤纸上不添加茶树油的培养皿为空白对照。每处理重复3次。将接种后的培养皿密封后置于25℃培养箱中。接种2、4、6、8、10 d后，观察记录菌丝的长势，并测量培养皿的菌落直径。待相应对照培养皿长满时停止观察和测量。每个菌落按十字交叉法测量2次，取其平均值代表菌落的大小，抑菌率计算公式为：

抑菌率（%）=（dC-dT）×100/（dC-0.8）。

式中，dC：对照菌落直径（cm）；dT：不同处理条件下的菌落直径（cm）；0.8：接种菌块的直径（cm）。

1.2.2 数据记录与分析

采用Excel 和DPS 软件对数据进行分析，所有试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 不同浓度茶树油对菌丝生长速率的影晌

2.1.1 芒果炭疽菌菌丝生长速率

不同浓度的茶树油处理后，芒果炭疽菌菌丝生长速率不同，结果见图1。

从图1可以看出，与空白试验对照，加入茶树油后芒果炭疽菌菌丝的生长速率都减缓、速率增长梯度减小，在第4天的菌丝生长直径中，大于300 μL/L几乎不长菌丝，且随着茶树油浓度的逐步加大，菌丝的生长速率越来越小、增长梯度趋于平缓。当茶树油浓度为400和500 μL/L时，菌丝几乎停止生长，说明茶树油浓度大于400 μL/L时，对芒果炭疽菌菌丝的抑制效果明显。

2.1.2 香蕉炭疽菌菌丝生长速率

不同浓度的茶树油处理后，香蕉炭疽菌菌丝生长速率不同，结果见图2。

与空白试验对照，加入茶树油后的香蕉炭疽菌菌丝生长速率也都减缓、速率增长梯度也减小，随着茶树油浓度的逐步加大，菌丝的生长速率越来越小、增长梯度趋于平缓，且茶树油的抑制效果很强，在对照组培养皿长满菌丝时，浓度为360 μL/L组的菌丝几乎不长。但随着时间的增长，抑菌作用在减小。茶树油浓度为240～360 μL/L时，菌丝生长速率接近，差异不显著，说明240 μL/L浓度的茶树油即可对香蕉炭疽病菌产生明显的抑制作用。

2.2 抑菌率

2.2.1 芒果炭疽病抑菌率

不同浓度茶树油对芒果炭疽病抑菌率变化如表1所示。

由表1可知，空白对照与加茶树油有极显著差异，说明添加茶树油可以显著抑制芒果炭疽菌的生长，处理50与100 μL/L、100与200 μL/L间无显著差异，处理400与500 μL/L也无显著差异。可以得出，茶树油对芒果炭疽病菌有一定的抑制作用，且随着茶树油浓度的增加，抑制率也增强，400 μL/L以上浓度可以达到较高的抑制效果。以EC50作为衡量茶树油对不同病原菌菌丝生长抑制活性大小的指标，茶树油对芒果炭疽病菌的EC50为339.13 μL/L。

2.2.2 香蕉炭疽菌抑菌率

不同浓度茶树油对香蕉炭疽菌抑菌率变化见表2。

由表2可知，空白对照组与加茶树油组有极显著差异，处理60与120 μL/L、180与240 μL/L间有显著差异，处理120与180 μL/L无显著差异，处理240与300 μL/L、300与360 μL/L间也无显著差异。说明茶树油对香蕉炭疽病菌有一定的抑制作用，且浓度越大，抑制效果越显著。240 μL/L的浓度可以达到80%以上的抑菌率。实验结果表明，茶树油对香蕉炭疽病菌的EC50为143.10 μL/L。

3 结论与讨论

3.1 结论

不同浓度茶树油对芒果炭疽病菌和香蕉炭疽病菌均有抑制活性，随着浓度的不断增加，茶树油的抑菌作用越强，当茶树油浓度大于400 μL/L时，芒果炭疽病菌菌丝的抑菌效果显著；大于240 μL/L时，对香蕉炭疽病菌的抑制效果显著。茶树油对芒果炭疽病菌的EC50为339.13 μL/L，对香蕉炭疽病菌的EC50为143.10 μL/L，说明茶树油对香蕉炭疽菌抑制作用比芒果炭疽菌强。

3.2 讨论

目前，控制果蔬采后病害的主要手段是使用化学杀菌剂，但化学杀菌剂对人类健康及自然环境都有严重危害和影响，因此，这一问题已受到全世界关注[11]。如果品生产中通常采用波尔多、多菌灵等化学农药对鲜果进行处理，以减少果品贮藏运输过程中的损失及病虫害。运用此方法处理的果品，食用安全性差，难以达到绿色食品卫生要求[10]。茶树油是目前所知活性最强的天然抗菌剂，可高效、无毒、无刺激地杀死真菌和细菌[12]。在国际上，茶树油已广泛应用于医疗、化工等领域[12-13]。茶树油作为食品香料使用，早已获得美国的批准（FEMA号3902）[13]。茶树油在焙烤食品、软饮料、谷类早餐、糖果、油脂、冷冻乳制品、水果制品、粮食制品等中的平均使用浓度为10 mg/kg，平均最高浓度为50 mg/kg[13]。2003年，我国卫生部发布的公告中，已将茶树油列入食品香料名单[14]。这些都说明茶树油是一种高效、低毒、安全的杀菌剂，使用茶树油作为果蔬采后的生物杀菌剂，具有广阔前途。

朱德明等[10]采用琼脂培养基扩散法对茶树油对芭蕉炭疽病菌的抑制作用进行了研究，发现0.05%浓度的茶树油对其有明显抑制效应。静玮等[15]以香蕉果实为材料，采用菌丝生长速率方法测定不同剂量（0～40 μL）的茶树油及其主要成分（4-松油烯醇、α-松油醇、γ-松油烯和1.8-桉叶油素）对香蕉炭疽病菌的离体抗菌活性影响进行研究，结果表明，20～40 μL茶树油能显著抑制炭疽病菌的菌丝生长，且浓度越高，抑制效果越明显；接种炭疽病菌的果实经茶树油处理后，病斑直径显著小于未处理果实。本研究采用滤纸扩散法，得到茶树油对香蕉炭疽病菌的EC50为143.10 μL/L，说明茶树油的挥发扩散蒸汽也可有效抑制香蕉炭疽病菌，与静玮等[15]的研究结果一致。

张胡焕等[16]采用生长速率法测定10种常用杀菌剂对芒果炭疽病菌的毒力。结果表明：45%咪鲜胺EW对芒果炭疽病菌生长的抑制作用最强，其EC50值为0.01 mg/L；40%氟硅唑EC、25%丙环唑EC、95%苯醚甲环唑TC、50%扑海因WP的抑制作用相对较强，其EC50值为0.03～0.81 mg/L；96%睛菌唑TC、15%三唑酮WP、96%百菌清TC、30%醚菌酯WP的抑制作用较小，其EC50值为4～65.2 mg/L；50%代森锰锌WP抑制作用最小，其EC50值为105.0 mg/L。本实验研究结果表明，茶树油对芒果炭疽病菌EC50为339.13 μL/L，比大部分的化学杀菌剂都要低，更具优势。

综上所述，茶树油对香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌具有明显的抑制作用，而且具有安全无毒，操作方便的优势，在以后香蕉炭疽病和芒果炭疽病的防治中，茶树油具有广阔的应用前景。

致 谢 感谢海南大学园艺园林学院从心黎老师提供的香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌材料，特此致谢！

参 考 文 献

[1] 胡忆雪，姚 雷，黄 健，等. 茶树油对3种痤疮致病菌的抑制作用研究[J]. 上海交通大学学报：农业科学版，2011，29（1）：88-92.

[2] 丁 恺. 茶树油的性质、应用及市场发展[J]. 牙膏工业，2005（1）：44-46.

[3] 曹 维，朱建梅，俞励平，等. 河源引种互叶白千层精油抗菌实验研究[J]. 中药材，2013，36（6）：988-991.

[4] 李 娟，李小瑞. 茶树油的性质及其应用[J]. 日用化学工业，2003，33（5）：323-325.

[5] 张燕君，古佛政. 互叶白千层精油化学成分的研究[J]. 林产化学与工业，1998（3）：74-76.

[6] 胡美姣，李 敏，高兆银，等. 香蕉炭疽病菌不同菌株的特性比较[J]. 热带作物学报，2007，28（2）：87-91.

[7] 王万东，刘光华，尼章光，等. 芒果炭疽病的发生规律及综合防治[J]. 广东农业科学，2008，29（6）：67-69.

[8] 周亚奎，郑服丛. 香蕉炭疽病生物防治研究进展[J]. 广西热带农业，2008，24（1）：328-331.

[9] 陶凤云，张新妙，俞 军，等. 茶树油抗菌作用机理研究进展[J]. 中国抗生素杂志，2006，31（5）：261-266.

[10] 朱德明，丁 丽，匡 钰，等. 茶树油对芭蕉炭疽菌菌丝生长和孢子萌发的抑制活性[J]. 食品研究与开发，2008，29（6）：134-137.

[11] Salinero O， Garrido J J， Wandosell F， et al. Use of UV-C to reduce storage rot of table grape[J]. Postharvest Biology & Technology， 1998， 13（3）：171-181.

[12] Weseler A， Geiss H K， Saller R， et al. Antifungal effect of Australian tea tree oil on Malassezia pachydermmatis isolated from caninessuffering fromcutaneous skin disease[J]. SchweizArchtierheilkd， 2002， 144（5）： 215.

[13] Abdel Said W M， Abdel Ghafar N Y， Shelata S A M. Application of salicylic acid and aspinrin for induction of resistance to tomato plants against bacterial wit and its effect on endogenous normones[J].Ann Agric Sci Cairo， 1996， 41（2）： 1 007- 1 020.

[14] 肖凯军，银玉容，郭祀远，等. 白千层油及其在医药上的应用[J]. 中国现代应用药学，2001，18（6）：423-425.

[15] 静 玮，苏子鹏，朱德明，等. 茶树油熏蒸处理对香蕉采后炭疽病害的影响[J]. 农业工程学报，2011，27（5）：378-384.

[16] 张胡焕，谢艺贤，蒲金基，等. 常用杀菌剂及其混剂对芒果炭疽病菌的毒力测定[J]. 农药，2010，49（1）：64-65.